Praesens†Inscriptio praesens: OX11 0DE, Britannia, Aedificium Adamantum, Harwell Scientiae et Innovationis Hortus, Dietcote, Oxoniensis comitatus, Britannia, Diamond Light Source Co., Ltd., Centrum Imaginum Biologicarum Electronicarum.
Complexus 1 lucis colligentis centri reactionis (RC-LH1) est pars photosynthetica principalis bacteriorum phototrophicorum purpureorum. Duas structuras microscopii cryoelectronici complexus RC-LH1 ex *Rhodopseudomonas palustris* introduximus. Structura resolutionis 2.65 Å complexus RC-LH114-W constat ex quattuordecim ansis subunitatum LH1 circumdantibus RC, quae proteina W interrumpitur, dum complexus sine proteina W omnino est in compositione RC circumdata ab RC. Ansa LH1 clausa est sedecim subunitatum. Comparatio harum structurarum perspicuitatem praebet in dynamicam quinoni in complexu RC-LH1, inter quas mutationes conformationis antea indeterminatae cum quinonum ligatur in loco QB RC, necnon locum locorum auxiliarium ligationis quinoni, quae adiuvant ea transmittere ad RC. Structura unica proteini W impedit clausuram ansæ LH1, ita creans canalem ad accelerandam commutationem quinoni/quinoloni.
Energia a photosynthesi praebita fere omnem vitam in terra sustentare potest, et magnum potentiale pro biotechnologia solari habet. Dum photosynthesis globalem promovent, bacteria phototrophica purpurea etiam varios modos energiae et facultates metabolicas exhibent. Photosynthesis vitare et ut bacteria heterotrophica in tenebris crescere possunt, nitrogenium et dioxidum carbonis figere, hydrogenium producere, et composita aromatica degradare (1-3). Ut energia his processibus praebeatur, lux celeriter et efficaciter in energiam chemicam converti debet. Hic processus incipit cum complexus antennae lucem captans lucem absorbet et energiam captam ad centrum reactionis (RC) transfert, ita separationem oneris incipiens (4-7). Unitas fundamentalis photosynthesis in bacteriis phototrophicis purpureis constat ex RC typi 2, circumdata a complexo lucem captante 1 (LH1), complexo centrali RC-LH1 formante. LH1 formatur ex serie heterodimerorum αβ curvatorum, quorum unumquodque duas moleculas chlorophylli bacterialis (BChl) a et unum vel duo carotenoida (8-12) ligat. Simplicissima antenna LH1 constat ex 16 vel 17 αβ heterodimeris quae RC (9-13) in ansa clausa circumdant, sed in aliis complexibus centralibus, peptida transmembranalia continuitatem LH1 circumdantis interrumpunt, ita diffusionem quinoli/quinoni inter RC et complexum cytochromatis bc1 promoventes (11, 13-15). Planta phototrophica purpurea Rhodopseudomonas (Rps.) est organismus exemplar qui energiam et translationem electronum quae photosynthesis sustinet intellegere potest. Prima structura crystallina Rps. Exemplar complexus RC-LH1 palustris est RC, circumdata 15 ansis heterodimericis LH1, quae a proteino ignoto nomine "Protein W" (14) interrumpuntur. Protein-W deinde identificatum est ut RPA4402, quod est proteinum 10.5kDa inexplicatum cum tribus helicibus transmembranalibus (TMH) praedictis (16). Proponimus ut genum rpa4402, proteinum W codificans, in "pufW" renominare possimus, ut congruat cum nomenclatura adhibita pro genis subunitates RC-L, M (pufL, pufM) et LH1α, β (pufA, pufB) codificantibus. Curiose, proteinum W tantum in circiter 10% RC-LH1 adest, quod revelat Rps. palustris duos diversos complexus RC-LH1 producere. Hic, structuras cryo-EM (cryo-EM) altae resolutionis duorum complexuum principalium referimus, unum cum proteino W et 14 heterodimeris αβ, alterum sine proteino W et ansa clausa LH1 16 heterodimerorum. Structura nostra mutationem radicalem in intellectu complexus RC-LH1 Rps. palustris repraesentat, quia populationem homogeneam cuiusque variantis analyzavimus et satis resolutionis habemus ut unumquodque peptidum et pigmenta ligatorum necnon lipida et quinona affinia clare assignemus. Comparatio harum structurarum ostendit tres proteinas TMH-W, quae hactenus in nullo alio complexo RC-LH1 inventae sunt, canalem quinonicum generare ad commutationem quinoni/quinoloni accelerandam. Numerus locorum lipidorum et quinonorum conservatorum identificatorum est, et novam mutationem conformationis post combinationem quinoni et RC revelavimus, quae apta esse potest pro RC photosystematis II (PSII) organismorum phototrophicorum oxygenatorum. Nostrae inventiones novas perspicientias in cineticam ligationis et commutationis quinoni/quinoloni in complexo RC-LH1 principali bacteriorum phototrophicorum purpureorum praebent.
Ut studium accuratum duorum complexuum in *Rps. palustris* inventorum facilius fiat, singula RC-LH1 methodis biochemicis segregamus. Complexus proteinum W carens (deinceps ΔpufW appellatus) a stirpe gene pufW carente purificatus est (16), et unus tantum complexus RC-LH1 produci potest. Complexus proteinum W continens a stirpe producitur. Proteinum W huius stirpis cum notatione His 10x in extremo C-termino suo modificatur, ut complexus proteinum W continens cum plurimis proteinis W carentibus efficaciter combinari possit metallum immobilizando. Complexus efficaciter separatur (16) per Chromatographiam Affinitatis (IMAC).
Ut in Figura 1 demonstratur, ambo complexus continent trium subunitatum RC (RC-L, RC-M et RC-H) circumdatam antenna LH1. Structura 2.80-A complexi carentis proteino-W ostendit 16 heterodimeros αβ, ansa LH1 clausa formantes, quae RC omnino circumdat, posthac complexus RC-LH116 appellabitur. Structura 2.65 Å complexi continentis proteinum-W habet 14 heterodimerum LH1 interruptum a proteino-W, posthac RC-LH114-W appellabitur.
(A et B) Repraesentatio superficialis compositi. (C et D) Pigmenta conexa in baculis expressa. (E et F) Complexus a superficie cytoplasmatica observati peptida et subunitates LH1 in imaginibus repraesentata habent, et secundum horologium a lacuna proteini-W numerantur [congruens cum numeratione Rba. Complexus sphaeroides (13)]. Pro LH1-α, color subunitatis proteini flavus est; pro LH1-β, color subunitatis proteini caeruleus est; pro proteino-W, proteinum rubrum est; pro RC-H, cyanus est; pro RC-L, aurantiacus est; pro RC-M, purpureus. Cofactores baculis repraesentantur, viridis moleculas BChl et BPh a repraesentat, purpureus carotenoida repraesentat, et flavus moleculas UQ10 repraesentat. (G et H) Visus amplificatus lacunae proteini-W in regione aequivalente complexus RC-LH114-W (G) et complexus RC-LH116 (H). Cofactores in forma spatii implendi monstrantur, quinonum chelatum caeruleo colore ostenditur. Hiatus proteini-W linea caerulea punctata in (G) illustratur, et foramina parva ubi quinonum/quinololum in anulo LH116 diffunditur linea nigra punctata in (H) illustrantur.
Figura 1 (A et B) RC circumdatam ostendit ordinibus apertis vel clausis heterodimerorum LH1αβ, quorum unumquodque duos BChl et unum carotenoidum ligat (Figura 1, C et D). Studia priora demonstraverunt Rps esse complexum LH1. In via biosynthetica spirulinae xanthin, hae species mixtas populationes carotenoidum continent (17). Attamen, spiropyrroxanthin est carotenoidum praevalens et eius densitas est satisfactoria. Quapropter, spiroxanthin in omnibus locis ligationis LH1 imitari decrevimus. Polypeptida alpha et beta sunt TMH singula cum brevibus regionibus externis membranae (Figura 1, A, B, E, et F). Quamquam densitas 17 residuorum ad C-terminum non observata est, polypeptidum alpha a Met1 ad Ala46 in utroque complexu divisum est. Polypeptidum β a Gly4 ad Tyr52 in RC-LH116, et a Ser5 ad Tyr52 in RC-LH114-W redactum est. Nulla densitas 3 vel 4 residuorum N-terminalium vel 13 C-terminalium observata est (Figura S1). Analysis per spectrometriam massae complexus mixti RC-LH1 ex stirpe naturali praeparati ostendit regionem absentem ex scissione heterologa horum peptidum provenire (Figura S1 et S2). Formylatio N-terminalis α-Met1 etiam observata est (f). Analysis demonstravit α-peptidum ex residuis fMet1 ad Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 constare, et β-peptidum ex residuis Ser2 ad Ala53 constare, quod bene congruit cum mappa densitatis EM temperaturae humilis.
Coordinatio α-His29 et β-His36 BChls inter se positas facit; unumquodque heterodimerum αβ cum vicinis suis congregatur ut ansa aperta (RC-LH114-W) vel ansa clausa (RC-LH116) circa seriem pigmentorum excitonis copulatorum RC formet (Figura 1, C et D). Comparata cum fascia 877 nm RC-LH114-W, mutatio rubra absorptionis 880 nm RC-LH116 3 nm est (Figura 2A). Attamen, spectrum dichroismi circularis fere idem est (Figura 2B), quod indicat, quamquam clara differentia inter ansa aperta et clausa est, ambitum localem BChls valde similem esse. Mutatio rubra absorptionis fortasse ex motu thermali reducto et stabilitate aucta in ansa clausa oritur (18, 19), ex mutatione in copula pigmentorum ab ansa clausa causata (20, 21), vel ex combinatione horum duorum effectuum (11).
(A) Spectrum absorptionis ultravioletae/visibilis/prope infrarubrae, cuius cacumina pigmentis correspondentibus notata et ad cacumen BPh ad 775 nm normalizata sunt. (B) Spectrum dichroismi circularis ad absorptionem BChl ad 805 nm normalizatum. (C et D) Spectra ΔA selecta ex spectris absorptionis tempore resolutis complexus RC-LH114-W (C) et complexus RC-LH116 (D). Pro meliore comparabilitate, omnia spectra ad ∆A de −A ad 0.2 ps normalizata sunt. (E) Celeritas oxidationis cytochromatis c2 post irradiationem in praesentia variarum concentrationum UQ2 (vide Figuram S8 pro datis crudis). (F) In cellulis sub luce humilis, mediae vel altae intensitatis (10, 30 vel 300μMm-2 s-1, respective) cultis, subunitates proteini W et RC-L in complexo purificato et proportio membranae separatae. Gradum proteini per electrophoresis in gel SDS-polyacrylamidis et immunoassay determina (vide Figuram S9 pro datis crudis). Proportionem relativam ad complexum RC-LH114-W purificatum determina. Proportio stoichiometrica RC-L ad proteinum-W complexi est 1:1.
BChls in loco 1 in ansa αβ14 deformata RC-LH114-W (Figura 1, A, C, et E) propiores sunt donatori primario RC (P) 6.8 Å quam aequivalentes BChls in RC-LH116 (Figura 1, B, D, et F, et Figura S3); tamen, cinetica absorptionis transitoria duorum complexorum ostendit pro RC-LH114-W et RC-LH116, constantes temporales translationis energiae excitationis ab LH1 ad RC esse 40 ±4 et 44 ±3 ps (Figura 2). , C et D, Figura S4 et Tabula S2). Nulla etiam differentia significativa est in translatione electronica intra RC (Figura S5 et textus supplementarius relatus). Suspicamur artam correspondentiam temporis translationis energiae inter LH1 et RC-P deberi simili distantiae, anguli et energiae potentialis plurimum BChl in duabus ansa LH1. Videtur exploratio exemplaris energiae LH1 ad minimam distantiam attingendam non esse celerior quam translatio energiae directa a locis suboptimalibus ad RC. Ansa LH1 aperta in RC-LH114-W etiam motum thermalem parvi momenti sub condicionibus temperaturae humilis ad analysin structurae subire potest, et longior conformatio anularis αβ14 ad temperaturam ambientem ex distantia pigmentationis βBChls in positione RC 1 invenitur.
Complexus RC-LH116 continet 32 ​​BChls et 16 carotenoida, et dispositio eius generalis eadem est ac ea quae ex Thermochromatio (Tch.) pidpido [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), stirpe Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) et alga viridi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) obtenta est. Post ordinationem, tantum parvae deviationes in positionibus heterodimerorum αβ observatae sunt, praesertim 1-5, 15, et 16 (Figura S6). Praesentia proteini-W magnum impulsum in structuram LH1 habet. Tria TMHs eius brevibus ansis connexa sunt, N-terminali in latere luminis complexus et C-terminali in latere cytoplasmatico (Figurae 1A et 3, A ad D). Proteinum-W plerumque hydrophobicum est (Figura 3B), et TMH2 et TMH3 cum LH1αβ-14 interagunt ut superficiem transmembranalem forment (Figura 3, B et E ad G). Interfacies praecipue ex residuis Phe, Leu et Val in regione transmembranali constat. Haec residua aminoacidis hydrophobicis et pigmentis αβ-14 accumulantur. Quaedam residua polaria etiam ad interactionem conferunt, incluso vinculo hydrogenii inter W-Thr68 et β-Trp42 in superficie cavitatis complexae (Figura 3, F et G). In superficie cytoplasmatis, Gln34 iuxta gregem keto carotenoidum αβ-14 est. Praeterea, molecula n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) resoluta est, et cauda eius hydrophobica ad interfaciem inter proteinum-W et αβ-14 extensa est, et cauda lipidica in corpore fortasse locata est. Animadvertimus etiam regiones resolutionis C-terminales proteini W et RCH proximas esse, sed non intra fines interactionum specificarum formandarum (Figura 1, A et E). Attamen, interactiones in aminoacidis C-terminalibus non resolutis harum duarum proteinarum fortasse exstant, quae mechanismum ad proteinum W adsciscendi per compositionem complexus RC-LH114-W praebere possunt.
(A) Proteinum-W, quod interfaciem cum LH1αβ14 forma picta spectat, catenam lateralem virgae formae (rubrae) habet, in parte diagrammatis potentialis electrostatici depictam (superficies grisea perlucida cum gradu contorni 0.13). (B) Proteinum-W superficie colorata hydrophobica repraesentatum. Areae polares et oneratae colore caeruleo, areae hydrophobicae colore albo, et areae fortiter hydrophobicae colore aurantiaco exhibentur. (C et D) Proteinum-W in picta repraesentatum, cuius orientatio eadem est ac in (A) (C), et 180° rotata (D). Secundum positionem in sequentia, residua distinguibilia schema colorum iridis assumunt, ubi N-terminalis caeruleus est et C-terminalis ruber. (E) Proteinum-W in eadem visione ac in (A), et residua ad interfaciem proteini-W:LH1 virgis cum notis annexis repraesentantur. (F) Proteinum-W 90° rotatur respectu (E) et LH1αβ14 in repraesentatione delineata, et respectu residuorum interfaciei in repraesentatione columnata. Residua prominentia polypeptidi beta designata sunt. Cofactor ostenditur ut columna colori Figurae 1 congruens, β-DDM decompositum griseo colore ostenditur, et oxygenium rubro colore monstratur. (G) Visus in (F) 180° rotatur, cum residuis prominentibus polypeptidi alpha designati.
Proteinum-W heterodimerum αβ (quintum decimum in Figura 1F) substituit, ita clausuram ansae prohibens et primos tres heterodimeros αβ inclinans. Observatum est angulum inclinationis maximum primi heterodimeri αβ-1 respectu normalis pelliculae 25° ad 29° esse (Figura 1, A et E), qui formatus est inclinatione 2° ad 8° αβ-1 in anulo RC A, quod acriter contrastat cum LH116 (Figura 1, B et F). Heterodimeri secundus et tertius inclinantur 12° ad 22° et 5° ad 10°, respective. Ob impedimentum stericum RC, inclinatio αβ-1 secundum par αβ (quod sexto decimo αβ in Figura 1F respondet) non includit, ita hiatum clarum in anulo LH1 formans (Figura 1, A et E). Propter absentiam duorum heterodimerorum αβ, una cum amissione quattuor BChl et duorum carotenoidum, nullum carotenoidum ad subunitatem αβ-1 contortam ligat, quod efficit anulum LH114-W continentem 13 carotenoida (Vegetarian) et 28 BChl. Aestimationes resolutionis localis duorum complexuum in regionibus αβ1 ad 7 inferiores sunt quam illae reliquae ansae LH1, quod fortasse plasticitatem inherentem subunitatis LH1 iuxta locum RC QB reflectat (Figura 4).
Imagines RC-LH114-W (A et B) et RC-LH116 (C et D) ex eadem prospectu desuper/laterali (A et B) (A et C) et superficie cavitatis Figurae 1 (B et D) monstrantur. Claves coloratae a dextra monstrantur.
Solus alius complexus centralis characteristicus cum proportione stoichiometrica 1:14 est dimerus Rhodococci sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Attamen, proteina W et PufX nullam homologiam manifestam habent, et vim significantem in structuras LH1 suas respectivas exercent. PufX est TMH singularis cum dominio cytoplasmatico N-terminali quod cum latere cytoplasmatico subunitatis RC-H (13) interagitur in positione correspondente Rps. palustris LH116αβ-16. PufX canalem creat pro commutatione quinoni/quinoloni inter RC-LH1 et complexum cytochromatis bcl et praesens est in omni complexu centrali Rba. sphaeroides (13). Quamquam interfacies monomer-monomeri est in Rba. Dimerus sphaeroides RC-LH1-PufX in loco ligationis proteini W in RC-LH114-W situs est, et hiatus a PufX et proteino-W inductus in loco aequivalenti est (Figura S7A). Hiatus in RC-LH114-W etiam cum hypothetico canali quinoni (8) Pseudomonas rosea LH1 congruit, qui a peptidis non ad proteinum W vel PufX pertinentibus formatur (Figura S7B). Praeterea, canalis quinoni in Blc. LH1 viridis smaragdinus, formatus per exclusionem unius subunitatis γ (7), in loco simili situs est (Figura S7C). Quamquam a diversis proteinis mediatus, apparitio horum canalium quinoni/quinololi in loco communi in complexo RC-LH1 exemplum evolutionis convergentis esse videtur, indicando hiatum a proteino W creatum fortasse ut canalis quinoni fungi.
Hiatus in ansā LH114-W formationem regionis membranae continuae inter spatium internum complexus RC-LH114-W et membranam principalem permittit (Figura 1G), potius quam ut duas regiones per porum proteinicum, ut in proteinis, connectere. Complexus RC-LH116 similis est complexo clauso Tch. aciculari simili (22) (Figura 1H). Cum diffusio quinoni per membranam velocior sit quam diffusio per angustum canalem proteinicum, ansa aperta LH114-W celeriorem conversionem RC quam ansa clausa LH116 permittere potest, et diffusio quinoni in RC fortasse magis restricta est. Ut exploraremus num proteinum W conversionem quinonum per RC afficiat, experimentum oxidationis cytochromi in certa concentratione ubiquinoni 2 (UQ2) (analogus naturalis UQ10 cum cauda isopreni breviori) perfecimus (Figura 2E). Quamquam praesentia quinoni chelati accuratam determinationem constantis Michaelis apparentis impedit (RC-LH114-W et RC-LH116 aptae sunt pro 0.2±0.1μM et 0.5±0.2μM respective), maxima celeritas RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) est 28±5% maior quam RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Initio aestimavimus proteinum-W in circiter 10% complexus centralis praesens esse (16); hic, rationes occupationis cellularum crescentium sub luce debili, media, et alta sunt 15±0.6%, 11±1% et 0.9±0.5% respective (Figura 2F). Comparatio quantitativa spectrometriae massae ostendit additionem notae histidini non minuisse abundantiam relativam proteini-W comparata cum stirpibus typicis (P = 0.59), ergo hi gradus non sunt artefactum proteini-W modificati (Figura S10). Attamen, haec humilis occupatio proteini-W in complexu RC-LH1 permittere potest quibusdam RCs ut accelerato gradu invertant, ita mitigando tardiorem commutationem quinoni/quinoloni in complexu RC-LH116. Animadvertimus magnam rationem occupationis lucis discrepare cum recentioribus datis transcriptomicis, quae indicant expressionem geni pufW augeri sub luce forti (Figura S11) (23). Discrimen inter transcriptionem pufW et incorporationem proteini W in complexum RC-LH1 confusum est et fortasse regulationem complexam proteini reflectat.
In RC-LH114-W, 6 cardiolipina (CDL), 7 phosphatidylcholina (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) et 29 β-DDM moleculae allocantur et in ea modelantur: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG et 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A et B). In his duabus structuris, CDL fere in latere cytoplasmatico complexus sita est, dum POPC, POPG et β-DDM plerumque in latere luminali sitae sunt. Duae moleculae lipidorum et detergentium in regione αβ-1 ad αβ-6 complexus RC-LH114-W isolatae sunt (Figura 5A), et quinque in regione aequivalente RC-LH116 isolatae sunt (Figura 5B). Plura lipida in altera parte complexus inventa sunt, praesertim CDL, inter RC et αβ-7 ad αβ-13 accumulata (Figura 5, A et B). Alia lipida et detergentia structuraliter resoluta extra anulum LH1 sita sunt, et catenae acylicae bene resolutae inter subunitates LH1 extenduntur, quae tentative ut β-DDM in RC-LH114-W designantur, et ut β-DDM in RC definitae sunt. Mixtura β-DDM et POPC-LH116. Similes positiones lipidorum chelantium et detergentium in nostra structura indicant ea esse loca ligationis physiologice pertinentia (Figura S12A). Positiones molecularum aequivalentium in Tch etiam bonam constantiam habent. Stirps Lenis et Trv. 970 RC-LH1s (Figura S12, B ad E) (9, 12) et residua hydrogenii nexus gregis capitis lipidici conservationem satis bonam in ordinatione sequentiae demonstraverunt (Figura S13), indicando CDL conservatam quae ad RC ligatur (24), haec loca in complexo RC-LH1 conservari posse.
(A et B) Peptida RC-LH114-W (A) et RC-LH116 (B) imaginibus picturis repraesentantur, pigmenta autem baculis, schema colorum in Figura 1 utentes. Lipida rubro colore, detergentia autem griseo colore monstrantur. UQ locis RC QA et QB coniuncta flavum est, dum UQ isolata caerulea est. (C et D) Eaedem imagines ac (A) et (B), lipidis omissis. (E ad G) Imago amplificata Q1(E), Q2(F) et Q3(G) ex RC-LH116, cum catenis lateralibus quae se invicem afficiunt. Nexus hydrogenii lineis nigris punctatis monstrantur.
In RC-LH116, et RC QA et QB UQ, quae in translatione electronum in processu separationis oneris participant, in locis suis ligationis decomponuntur. Attamen, in RC-LH114-W, quinona QB non resoluta est et infra fusius tractabitur. Praeter quinonas QA et QB, duae moleculae UQ chelatae (inter anulos RC et LH1 sitae) in structura RC-LH114-W secundum greges capita bene resolutos (in Q1 et Q2 respective sitos) assignantur. (Figura 5C). Duae unitates isopreni Q1 assignantur, et tabula densitatis decem caudas isopreni Q2 completas resolvit. In structura RC-LH116, tres moleculae UQ10 chelatae (Q1 ad Q3, Figura 5D) resolutae sunt, et omnes moleculae densitatem claram per caudam habent (Figura 5, D ad G). In duabus structuris, positiones capitum quinonicorum Q1 et Q2 constantiam excellentem habent (Figura S12F), et cum RC tantum interagunt. Q1 ad introitum lacunae W RC-LH114-W sita est (Figura 1G et 5, C, D et E), et Q2 prope locum ligationis QB sita est (Figura 5, C, D) et F). Residua L-Trp143 et L-Trp269 conservata Q1 et Q2 proxima sunt et potentiales interactiones π-stacking praebent (Figura 5, E et F, et Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å ab oxygenio distali Q1, vinculum hydrogenii firmum praebet (Figura 5E); hoc residuum in omnibus RC praeter relationem distantissimam conservatur (Figura S13). L-Ser91 conservative pro Thr in plerisque aliis RCs substituitur (Figura S13), 3.8 Å ab oxygenio methylico Q1 distat, et fortasse nexus hydrogenii debiles praebet (Figura 5E). Q3 non videtur interactionem specificam habere, sed in regione hydrophobica inter subunitatem RC-M et subunitatem LH1-α 5 ad 6 locatur (Figura 5, D et G). Q1, Q2 et Q3 vel propinquae chelatae quinonae etiam in Tch. Gentle, Trv. Strain 970 et Blc resolutae sunt. Structura iridis (9, 10, 12) ad locum conservatum ligationis quinoni auxiliaris in complexo RC-LH1 indicat (Figura S12G). Quinque UQ decompositae in RC-LH116 bene congruunt cum 5.8±0.7 cuiusque complexi determinati per chromatographiam liquidam altae efficaciae (HPLC), dum tres UQ decompositae in RC-LH114-W inferiores sunt. Valor mensus 6.2±0.3 (Fig. S14) indicat moleculas UQ non resolutas in structura esse.
Polypeptida pseudo-symmetrica L et M singula quinque TMH continent et heterodimerum formant quod unum dimerum BChl, duo monomera BChl, duo monomera bacteriophagi (BPh), et unum ferrum non-hemicum et unam vel duas moleculas UQ10 coniungit. Propter praesentiam vinculorum hydrogenii in grege cetone terminali et eius accumulationem notam in Rps, carotenoida in subunitate M incorporantur, quae cis-3,4-dehydroorhodopinum nominatur. Species (25). Dominium membranae externae RC-H membranae per unum TMH ancoratur. Structura RC universa similis est trium subunitatum RC specierum affinium (ut Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Macrocycli BChl et BPh, spina carotenoidis et ferrum non-hemicum intra ambitum resolutionis harum structurarum se tegunt, sicut grex capitis UQ10 in loco QA et quinona QB in RC-LH116 (Figura S15).
Duae structurae RC cum diversis ratibus occupationis situs QB praesto novam occasionem praebent ad examinandas mutationes conformationis constantes quae ligationem quinoni QB comitantur. In complexo RC-LH116, quinonum QB in positione "proximali" plene ligati locatum est (26), sed separatio RC-LH114-W quinonum QB non habet. Nullum quinonum QB in RC-LH114-W est, quod mirum est quia complexus activus est, magis quam complexus RC-LH116 cum quinono QB structuraliter resoluto. Quamquam duo anuli LH1 circiter sex quinonas chelant, quinque structuraliter resoluti sunt in anulo RC-LH116 clauso, dum tantum tres structuraliter limitati sunt in anulo RC-LH114-W aperto. Haec aucta perturbatio structuralis fortasse celeriorem substitutionem situs QB RC-LH114-W, celeriorem cineticam quinoni in complexo, et auctam probabilitatem transeundi ansam LH1 reflectere potest. Suggerimus defectum UQ in situ RC QB situs RC-LH114-W fortasse ex complexo magis complexo et activo provenire, et situm QB situs RC-LH114-W statim in conversione UQ congelatum esse. Stadium specificum (introitus ad situm QB clausus est) conformationem huius activitatis reflectere.
Sine QB, rotatio concomitantis L-Phe217 ad positionem quae cum nexu UQ10 incompatibilis est, quia collisionem spatialem cum prima unitate isopreni caudae efficiet (Figura 6A). Praeterea, mutationes conformationis principales manifestae sunt, praesertim helix de (helice brevis in ansa inter TMH D et E) ubi L-Phe217 ad loculum nexus QB movetur et rotatio L-Tyr223 (Figura 6A) ad rumpendum nexum hydrogenii cum structura M-Asp45 et claudendum introitum loci nexus QB (Figura 6B). Helix de ad basin suam pivotat, Cα L-Ser209 0.33 Å movetur, dum L-Val221Cα 3.52 Å movetur. Nullae mutationes observabiles in TMH D et E sunt, quae in ambabus structuris superimponibiles sunt (Figura 6A). Quantum scimus, haec est prima structura in cellula radioactiva naturali quae locum QB claudit. Comparatio cum structura completa (QB-ligata) ostendit antequam quinonum reducatur, mutationem conformationis requiri ut in quinonum intret. L-Phe217 rotatur ut interactionem π-stacking cum capite quinoni formet, et helice extrorsum movetur, permittens sceleton L-Gly222 et catenam lateralem L-Tyr223 reticulum vinculorum hydrogenii cum structura vinculorum hydrogenii stabili forment (Figura 6, A et C).
(A) Imago imbricata hologrammatis (catena L, catena aurantiaca/M, purpurea) et structurae apo (cinereae), in qua residua principalia in forma repraesentationis virgae similis exhibentur. UQ10 virga flava repraesentatur. Linea punctata vincula hydrogenii in tota structura formata indicat. (B et C) Repraesentatio superficialis apolipoproteini et totius structurae anularis, oxygenium catenae lateralis L-Phe217 caeruleo colore et L-Tyr223 rubro colore respective illustrans. Subunitas L aurantiaca est; subunitates M et H non coloratae sunt. (D et E) Apolipoproteinum (D) et situs RC QB integri (E) [colorato per (A) respective] et PSII Thermophili thermophili (viridis, caeruleus cum quinono plastico; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Inopinato modo, quamquam plures structurae cellularum resonantiarum (RC) carentium QB sine LH1 praesto sunt, mutationes conformationis in hoc studio observatae antea non relatae sunt. Hae includunt structuram depletionis QB ex Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) et Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), quae omnes fere eaedem sunt ac structura QB generalis. Inspectio accurata 3PRC revelavit moleculas detergentis LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) se ad introitum positionis QB ligare, quod fortasse rearrangementum in conformationem clausam impedire potest. Quamquam LDAO non in eadem positione in 1EYS vel 1OGV decomponitur, hae RC eodem detergente praeparantur et ideo eundem effectum producere possunt. Structura crystallina Rba. Sphaeroides RC cum cytochroma c2 co-crystallizata (PDB ID: 1L9B) etiam locum QB clausum habere videtur. Attamen, hoc in casu, regio N-terminalis polypeptidi RC-M (cum loco ligationis QB per nexum H residui Tyr in helice Q interagens) conformationem innaturalem assumit, et mutatio conformationis QB ulterius non exploratur (30). Quod solatur est nos hunc deformationem polypeptidi M in structura RC-LH114-W non vidisse, quae fere eadem est ac regio N-terminalis RC RC-LH116. Etiam notandum est post eradicationem antennae LH1 detergentis fundatae, RCs apolipoproteinorum in PDB resolutas esse, quod piscinas quinonis internas et lipida in spatio inter RC et superficiem internam anuli LH1 circumdantis eliminavit (31, 32). RC functionale manet quia omnes cofactores retinet, praeter quinonum QB decomponibilem, quod minus stabile est et saepe per processum praeparationis perditur (33). Praeterea, constat remotionem LH1 et lipidorum cyclicorum naturalium ex RC impulsum habere posse in functiones, ut in vita breviori status P+QB a carica separata (31, 34, 35). Quapropter, coniecimus existentiam anuli LH1 localis RC circumdantis locum QB "clausum" conservare posse, ita ambitum localem prope QB conservans.
Quamquam apolipoproteinum (sine quinono QB) et structura completa tantum duas imagines momentaneas conversionis situs QB repraesentant, potius quam seriem eventuum, tamen indicia sunt nexum impediri posse ad nexum iteratum per hydroquinonum prohibendum, quo inhibitio substrati inhibetur. Interactio quinololi et quinoni prope situm QB apolipoproteini fortasse differet, quod ad eius reiectionem a RC ducit. Iamdiu propositum est mutationes conformationis partes agere in nexu et reductione quinonum. Facultas RC congelatarum ad quinona reducenda post adaptationem ad obscuritatem impeditur (36); crystallographia radiographica ostendit hoc damnum fieri quia quinona QB in conformatione "distali" circiter 4.5 Å a positione proximali activa inclusa sunt (26), 37). Suggerimus hanc conformationem nexus distalis esse imaginem momentam status intermedii inter apolipoproteinum et structuram anularem plenam, quae interactionem initialem cum quinono et aperturam situs QB sequitur.
RC typi II, in complexu PSII quarundam bacteriorum phototrophicorum et cyanobacteriorum, algarum et plantarum inventa, conservationem structuralem et functionalem habet (38). Ordinatio structuralis in Figura 6 (D et E) demonstrata similitudinem inter RC PSII et locum QB complexus RC bacterialis illustrat. Haec comparatio diu exemplar fuit ad systemata arcte conexa ligationis et reductionis quinoni studenda. Publicationes priores suggesserunt mutationes conformationis reductionem PSII quinonorum comitari (39, 40). Ergo, conservationem evolutionariam RC considerando, hic mechanismus ligationis antea non observatus etiam ad locum QB RC PSII in plantis phototrophicis oxygenatis applicari potest.
Stirpes Rps ΔpufW (deletione pufW sine inscriptione) et PufW-His (proteina W cum notatione C-terminali 10x His, ex loco naturali pufW expressa). *palustris* CGA009 in opere nostro priori descriptae sunt (16). Hae stirpes et parens isogenicus typus naturalis e congelatore recuperatae sunt per striationem parvi numeri cellularum in lamina PYE (quaeque 5 g litri -1) (in LB ad -80°C conservata, continenti 50% (w/v) proteinum glycerol), extractum fermenti et agar succinatum [1.5% (w/v)]. Lamina per noctem in tenebris ad temperaturam ambientem sub condicionibus anaerobicis incubata est, deinde luce alba (~50 μmolm -2 s -1) a bulbis halogenicis OSRAM 116-W (RS Components, UK) provisa per 3 ad 5 dies illuminata, donec colonia singularis apparuit. Colonia singularis adhibita est ad inoculandos 10 ml medii M22+ (41) cum 0.1% (w/v) casaminoacidorum (deinceps M22 appellatorum) supplemento. Cultura sub condicionibus oxygenii humilis in tenebris ad 34°C cum agitatione ad 180 rpm per 48 horas culta est, deinde 70 ml culturae sub iisdem condicionibus per 24 horas inoculata est. Cultura semi-aerobica cum volumine 1 ml adhibita est ad inoculandos 30 ml medii M22 in ampulla vitrea pellucida cum operculo cochleato universali 30 ml et irradiata cum agitatione (~50μmolm-2 s-1) per 48 horas virga agitatoria vi magnetica sterili. Deinde 30 ml culturae cum circiter 1 litro culturae sub iisdem condicionibus inoculata est, quod deinde ad inoculandos circiter 9 litras culturae illuminatae ad ~200 μmolm-2 s-1 per 72 horas adhibitum est. Cellulae centrifugatione ad 7132 RCF per 30 minuta collectae sunt, in ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8.0) resuspensae, et ad -20°C donec opus esset conservatae.
Post liquefactionem, cellulis resuspensis adde crystallos aliquos deoxyribonucleasis I (Merck, UK), lysozymi (Merck, UK) et duas tabulas inhibitoris proteasis holoenzymi Roche (Merck, UK). In cella pressionis Gallicae 20,000 psi (Aminco, USA), cellulae 8 ad 12 vicibus disruptae sunt. Post remotionem cellularum integrarum et fragmentorum insolubilium per centrifugationem ad 18,500 RCF per 15 minuta ad 4°C, membrana a lysato pigmentato praecipitata est per centrifugationem ad 113,000 RCF per 2 horas ad 43,000°C. Fractionem solubilem abice et membranam coloratam in 100 ad 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) resuspende et homogeneiza donec nullae aggregationes visibiles sint. Membrana suspensa in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) continenti 2% (w/v) β-DDM per unam horam in tenebris ad 4°C sub leni agitatione incubata est. Deinde centrifuga ad 70°C ad dissolvenda 150,000 RCF ad 4°C per unam horam ad removenda residua insolubilia.
Membrana solubilis ex stirpe ΔpufW columnae commutationis ionicae DEAE Sepharose 50 ml cum tribus voluminibus columnae (CV) solutionis ligandae [20 mM tris-HCl (pH 8.0) continentis 0.03% (w/v) β-DDM] applicata est. Columna duobus solutionibus ligandis CV lavatur, deinde columna duobus solutionibus ligandis 50 mM NaCl continentibus lavatur. Complexus RC-LH116 elutus est gradiente lineari 150 ad 300 mM NaCl (in solutione liganda) in 1.75 CV, et complexus ligandi reliquus elutus est solutione liganda 300 mM NaCl continenti in 0.5 CV. Spectrum absorptionis inter 250 et 1000 nm collige, fractionem cum ratione absorptionis (A880/A280) maiore quam 1 apud 880 ad 280 nm serva, bis in liquore ligante dilue, et eadem methodus iterum in columna DEAE post purificationem adhibe. Fractiones cum rationibus A880/A280 maioribus quam 1.7 et rationibus A880/A805 maioribus quam 3.0 dilue, tertium circuitum commutationis ionicae perage, et fractiones cum rationibus A880/A280 maioribus quam 2.2 et rationibus A880/A805 maioribus quam 5.0 retine. Complexum partim purificatum ad ~2 ml in filtro centrifugo Amicon 100,000 cum limine ponderis molecularis (MWCO) (Merck, UK) concentratum est, et in columnam exclusionis magnitudinis Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) continentem 200 mM NaCl tamponis impositum, deinde in eadem tampone ad 1.5 CV elutum est. Spectra absorptionis fractionis exclusionis magnitudinis collige, et spectra absorptionis cum rationibus A880/A280 supra 2.4 et rationibus A880/A805 supra 5.8 ad 100 A880 concentra, et statim ea ad praeparationem vel conservationem clathri cryo-TEM utere. Ad -80°C serva donec opus sit.
Membrana solubilis ex stirpe PufW-His applicata est columnae HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) continenti 200 mM NaCl et 0.03% (w/w)) in solutione tampone IMAC (GE Healthcare). [v) β-DDM]. Columna abluta est quinque CV solutionis tamponis IMAC, deinde quinque CV solutionis tamponis IMAC continentis 10 mM histidini. Complexus centralis elutus est e columna quinque solutionibus tamponis IMAC continentibus 100 mM histidini. Fractio continens complexum RC-LH114-W concentratur ad ~10 ml in cisterna agitata instructa filtro Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), diluitur vicies solutione tampone ligante, et deinde additur ad 25 ml. In columna DEAE Sepharose, quattuor CV solutioni tamponi ligante prae-usurpantur. Columnam quattuor liquoribus ligantibus CV lava, deinde complexum in octo CV in gradiente lineari ab 0 ad 100 mM NaCl (in liquore ligante) elue, et reliqua quattuor CV liquore ligante 100 mM continentia. Complexus residui in fractionibus natrii chloridi cum ratione A880/A280 maiore quam 2.4 et ratione A880/A805 maiore quam 4.6 coniuncti eluti sunt. Complexus residui in filtro centrifugo Amicon 100,000 MWCO ad ~2 ml concentrati sunt, et columna exclusionis magnitudinis Superdex 200 16/600 cum liquore IMAC 1.5 CV impleti sunt, antea in liquore aequilibrato cum liquore IMAC 1.5 CV impleti, et deinde in eadem liquore supra 1.5 CV eluti. Spectra absorptionis fractionum exclusionis magnitudinis collige et spectra absorptionis cum rationibus A880/A280 supra 2.1 et rationibus A880/A805 supra 4.6 ad 100 A880 concentra, quae statim ad praeparationem reticuli TEM congelati adhibentur vel ad -80°C servantur donec opus sit.
Ad reticula immersionis Leica EM GP praeparanda, reticula TEM temperaturae humilis adhibita sunt. Complexum in solutione IMAC ad A880 = 50 dilutum est, deinde 5 μl in reticulum cupreum QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbone obductum (Agar Scientific, UK) nuper emissis et incandescenti impositum est. Reticulum ad 20°C et humiditatem relativam 60% per 30 s incuba, deinde per 3 s sicca, et denique in ethano liquido ad -176°C extingue.
Data complexus RC-LH114-W in eBIC (Electronic Biomaging Center) (British Diamond Light Source) microscopio Titan Krios, quod tensione acceleratrice 300kV, magnificatione nominali 130,000× et energia - operatur, capta sunt. Hiatus 20 eV elige. Imagines in modo numerandi captae ad data colligenda, Gatan 968 GIF Quantum cum detectore K2 peak adhibitum est. Magnitudo pixel calibrata 1.048 Å est, et dosis ratio 3.83 e-Å⁻²s⁻¹, pellicula intra 11 secundas collecta et in 40 partes divisa est. Area carbone obducta ad microscopium refocalizandum adhibita est, deinde tres pelliculas per foramen collige. In summa, 3130 pelliculae collectae sunt, cum valoribus defocalizationis inter -1 et -3 μm.
Data de complexo RC-LH116 eodem microscopio in Laboratorio Biostructurae Asterbury (Universitate Leodis, Britannia) collecta sunt. Data modo numerandi cum amplificatione 130 k collecta sunt, et magnitudo pixelorum ad 1.065 Å cum dosi 4.6 e-Å-2s-1 calibrata est. Pellicula intra 12 secundas capta et in 48 partes divisa est. In summa, 3359 pelliculae collectae sunt, cum valoribus defocalisationis inter -1 et -3 μm.
Omnis processus datorum in canali Relion 3.0 (42) perficitur. Adhibe Motioncorr 2 (43) ad motum fasciculi corrigendum per ponderationem dosis, deinde utere CTFFIND 4.1 (44) ad parametrum CTF (functionem translationis contrastus) determinandum. Photomicrographa typica post haec prima stadia processus in Figura 2. S16 monstrantur. Formula selectionis automaticae generatur manualiter selectis circiter 250 pixelis 1000 particularum in quadro 250 pixelorum et nulla classificatione bidimensionali (2D) referentiali, ita reiciendis classificationibus quae contaminationem exempli inveniunt vel nullas notas discernibiles habent. Deinde, selectio automatica in omnibus microphotographis peracta est, et RC-LH114-W 849,359 particulas, et complexus RC-LH116 476,547 particulas continebat. Omnes particulae selectae duos circuitus classificationis bidimensionalis (non-referentialis) subierunt, et post unumquemque cursum, particulae quae aream carbonis, contaminationem exempli, nullas notas manifestas vel particulas valde imbricatas attingunt, reiciuntur, quod resultat in 772,033 (90.9%) et 359,678 (75.5%) particulis. Hae particulae ad classificationem tridimensionalem RC-LH114-W et RC-LH116 respective adhibitae sunt. Initiale exemplar tridimensionale referentiale generatum est utens methodo stochastica descensus gradientis. Adhibito exemplo initiali ut referentia, particulae selectae in quattuor categorias tridimensionales digeruntur. Adhibito exemplo huius categoriae ut referentia, refinationem tridimensionalem in particulis maximae categoriae perage, deinde adhibe initiali filtro low-pass 15Å ad aream solventis tegendam, adde 6 elementa marginum molium, et elementa post-processa ad functionem translationis Modulationis apicis Gatan K2 detectoris superioris corrigendam. Pro collectione datorum RC-LH114-W, hoc exemplar initiale modificatum est per remotionem densitatis validae ad margines personae (quae a densitate complexus nuclei in Chimera UCSF disiuncta erat). Exemplaria inde orta (cuarum resolutiones RC-LH114-W et RC-LH116 sunt 3.91 et 4.16 Å respective) ut exemplar pro secundo circuitu classificationis 3D adhibentur. Particulae adhibitae in classem 3D initialem congregantur nec correlationem validam cum vicinia habent. Intersectio vel absentia proprietatum structuralium manifestarum. Post secundum circuitum classificationis 3D, categoria cum maxima resolutione selecta est [Pro RC-LH114-W, una categoria est 377,703 particulae (44.5%), pro RC-LH116, duae categoriae sunt, in summa 260,752 particulae (54.7%) continentes, ubi eaedem sunt solum cum post rotationem initialem cum parva differentia alignantur]. Particulae selectae in arca 400 elementorum elementorum iterum extrahuntur et per refinationem tridimensionalem (3D) refinuntur. Persona solventis generatur utens filtro initiali 15 Å transiens inferiorem, expansione mappae trium elementorum elementorum elementorum, et persona molli trium elementorum ...
Omnes sequentiae proteinorum ex UniProtKB receptae sunt: ​​LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) adhibitum est ad exemplar homologiae RC construendum, quod sequentias proteinorum RC-L, RC-M et RC-H necnon structuram crystallinam Rba continet. RC sphaeroides ut exemplar adhibitum est (PDB ID: 5LSE) (46). Instrumento "fit map" in UCSF Chimera utere ad exemplar generatum mappae aptandum (47), structuram proteini emendandam, et cofactor [4×BChl a (nomen residui bibliothecae monomerorum = BCL), 2×BPh a (BPH), unum vel duo genera UQ10 (U10), unum ferrum non-haemicum (Fe) et unum 3,4-dihydrohexacarbonylcholinum (QAK)] addendum Coot (48) adhibe. Quoniam QAK in bibliotheca monomerorum non praesto est, instrumento eLBOW in PHENIX (49) parametrizatum est.
Deinde, subunitas LH1 constructa est. Initio, instrumentum constructionis automaticae in PHENIX (49) adhibitum est ad partem sequentiae LH1 automatice construendam, mappa et sequentiis proteinorum LH1-α et LH1-β ut input utens. Subunitatem LH1 perfectissimam elige, extrahe et in Coot impone, sequentiam desideratam in ea manu adde, et totam structuram manu refina antequam duas BCl a (BCL) et spirilloxanthinum (CRT) addas [secundum Rps pertinentes. Densitas complexus LH1 et contentum carotenoidum notum. Species (17)]. Subunitatem LH1 completam exscribe, et "Docking Map Tool" UCSF Chimera utere ad aream adiacentem non-modellatam densitatis LH1 figendum, deinde eam in Coot refina; processum repete donec omnes subunitates LH1 modellatae sint. Pro structura RC-LH114-W, per extractionem densitatis non assignatae in Coot, proteina a reliquis componentibus non-proteinicis in mappa Chimera USCF segmentatur et instrumentum Autobuild adhibitus est ad exemplar initiale constituendum, et reliquas subunitates (proteinum-W) Modelizando. In PHENIX (49). Quaslibet sequentias desuntes ad exemplar resultantem in Coot (48) adde, et deinde totam subunitatem manualiter refina. Densitas non assignata reliqua combinationem lipidorum (ID bibliothecae monomerorum PDB CDL = CDL, POPC = 6PL et POPG = PGT), detergentis β-DDM (LMT) et molecularum UQ10 (U10) aptat. Optimizationem PHENIX (49) et optimizationem manualem in Coot (48) utere ad exemplar initiale completum perficiendum donec statisticae exempli et qualitas visualis aptationis ulterius emendari non possint. Denique, LocScale (50) utere ad mappam localem acuendam, et deinde plures alios cyclos modelationis densitatis non assignatae et optimizationis automaticae et manualis perage.
Peptida, cofactores, aliaque lipida et quinona, intra densitates suas respective coniuncta, in Figuris 1 et 2, S18 ad S23, monstrantur. Informationes statisticae exempli finalis in Tabula S1 exhibentur.
Nisi aliter specificatum est, spectra absorptionis UV/Vis/NIR in spectrophotometro Cary60 (Agilent, USA) intervallis 1 nm ab 250 nm ad 1000 nm et tempore integrationis 0.1 s collecta sunt.
Exemplum in cuveta quartzosa cum semita 2 mm ad A880 valoris 1 dilue, et spectrum absorptionis inter 400 et 1000 nm collige. Spectra dichroica circularia in spectropolarimetro Jasco 810 (Jasco, Iaponia) intervallis 1 nm inter 400 nm et 950 nm, celeritate scansionis 20 nm min-1 collecta sunt.
Coefficiens extinctionis molaris determinatur diluendo complexum centrale ad A880 circiter 50. Dilue volumen 10 μl in 990 μl solutionis ligans vel methanoli, et collige spectrum absorptionis statim ad degradationem BChl minuendam. Contentum BChl cuiusque exempli methanoli calculatum est per coefficientem extinctionis ad 771 nm 54.8 mM⁻¹ cm⁻¹, et coefficiens extinctionis determinatus est (51). Divide concentrationem BChl mensam per 32 (RC-LH114-W) vel 36 (RC-LH116) ad determinandam concentrationem complexus centralis, quae deinde adhibetur ad determinandum spectrum absorptionis eiusdem exempli in solutione liquefacta parallela collecti. Coefficiens extinctionis. Tres mensurae repetitae captae sunt pro quolibet exemplo, et absorptio media Qy maximae BChl ad calculationem adhibita est. Coefficiens extinctionis RC-LH114-W ad 878 nm mensus est 3280±140 mM⁻¹ cm⁻¹, dum coefficiens extinctionis RC-LH116 ad 880 nm mensus est 3800±30 mM⁻¹ cm⁻¹.
UQ10 secundum methodum in (52) quantificatum est. Breviter, HPLC phasis reversae (RP-HPLC) per systema Agilent 1200 HPLC peracta est. Circiter 0.02 nmol RC-LH116 vel RC-LH114-W in 50μl methanoli:chloroformii 50:50 continentis 0.02% (w/v) chloridi ferrici dissolvere, et Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm prae-aequilibratum inicere. Dissolvere in 1 ml⁻¹ min⁻¹ ad 40°C in solvente HPLC (80:20 methanolum:2-propanol) in columna ×25 cm. Elutionem isocraticam in solvente HPLC perficere ad absorptionem ad 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoida) et 780 nm (BChl) per 1 horam. Apex in chromatogrammate 275 nm post 25.5 minuta integratus est, quod nullos alios compositos detectabiles continebat. Area integrata adhibita est ad quantitatem molaris UQ10 extractae calculandam cum respectu curvae calibrationis ex iniectione purorum standardorum ab 0 ad 5.8 nmol calculatae (Figura S14). Quaeque specimina tribus replicationibus analysata sunt, et error relatus SD mediae respondet.
Solutio continens complexum RC-LH1 cum absorptione Qy maxima 0.1 parata est cum 30 μM cytochromatis c2 cordis equini reducti (Merck, UK) et 0 ad 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tria exempla 1 ml-mensurata ad singulas concentrationes UQ2 parata et per noctem in tenebris ad 4°C incubata sunt ut adaptatio completa ad tenebras ante mensurationem curaretur. Solutio in spectrophotometrum modularem OLIS RSM1000 instructum flamma 300 nm/cratico lineari 500, introitu 1.24 mm, rimis mediis 0.12 mm et exitu 0.6 mm immissa est. Filtrum longum 600 nm ad introitum phototubi speciminis et tubi photomultiplicatoris referentialis collocatum est ad lucem excitationis excludendam. Absorptio ad 550 nm cum tempore integrationis 0.15 s observata est. Lux excitationis a LED (diodo electroluminescente) M880F2 880 nm (Thorlabs Ltd., UK) per funem fibrae opticae intensitate 90% per moderatorem DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) emittitur et ad fontem lucis angulo 90° emittitur. Radius mensurans speculo oppositus est ut lucem quamlibet quae initialiter a specimine non absorpta est reddat. Absorptio 10 s ante illuminationem 50 s observanda est. Deinde absorptio per 60 s in tenebris ulterius observata est ad aestimandum quatenus quinololum sponte cytochroma c23+ reducit (vide Figuram S8 pro datis crudis).
Data tractata sunt aptando ratem initialem linearem intra 0.5 ad 10 secundas (pro concentratione UQ2) et mediando rates omnium trium exemplorum ad singulas concentrationes UQ2. Concentratio RC-LH1 computata per coefficientem extinctionis respectivum adhibita est ad convertendam ratem in efficientiam catalyticam, in Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) depictam, et aptata ad exemplar Michaelis-Menten ad valores apparentes Km et Kcat determinandos.
Ad mensuras absorptionis transitoriae, exemplum RC-LH1 ad ~2μM dilutum est in solutione IMAC cum 50 mM natrii ascorbati (Merck, USA) et 0.4 mM Terbutini (Merck, USA). Acidum ascorbicum ut donator electronum sacrificialis adhibetur, et tert-butaclofen ut inhibitor QB adhibetur ut donator RC principalis per totum processum mensurae reductus maneat (id est, non photooxidatus). Circiter 3 ml exempli additur cellulae rotanti consuetudinariae (circiter 0.1 m diametro, 350 RPM) cum longitudine viae opticae 2 mm ut exemplum in via laser satis temporis habeat ad adaptationem obscuritatis inter impulsus excitationis. Usi impulsibus laser ~100-fs ad amplificandum systema laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) ad excitandum exemplum ad 880 nm cum frequentia repetitionis 1 kHz (20 nJ pro NIR vel 100 nJ pro Vis). Antequam notitias colligas, exemplum luci excitationis per circiter triginta minuta expone. Expositio inactivationem QA efficiet (QA semel vel bis fortasse reducens). Sed nota bene hunc processum reversibilem esse, quia post longum adaptationis ad tenebras tempus, RC lente ad activitatem QA redibit. Spectrometrum Helios (Ultrafast Systems, USA) adhibitum est ad spectra transitoria metienda cum mora -10 ad 7000 ps. Programma Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) ad collectiones datorum separandas, deinde ad coniungendas et normam componendas adhibe. Programma CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) ad collectionem datorum compositam adhibendam ad spectra differentialia ad decrementum pertinentia obtinenda, vel functionem adhibe quae exponentes multiplices cum responso instrumenti convolvit ad evolutionem spectralem unius longitudinis undae in Origin (OriginLab, USA) aptandam.
Ut supra dictum est (53), pellicula photosynthetica complexum LH1 continens, antenna RC et antenna peripherica LH2 carens, praeparata est. Membrana in 20 mM tris (pH 8.0) diluta est, deinde in cuvetta quartzosa cum via optica 2 mm imposita. Impulsus lasericus 30nJ adhibitus est ad specimen excitandum ad 540 nm cum mora -10 ad 7000 ps. Seriem datorum sicut pro specimine Rps.pal descriptum est, tracta.
Membrana per centrifugationem ad 150,000 RCF per duas horas ad 4°C compacta est, deinde eius absorptio ad 880 nm in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) et 200 mM NaCl resuspensa est. Membranam dissolve per lente agitationem in 2% (w/v) β-DDM per unam horam in tenebris ad 4°C. Exemplum dilutum est in 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ad concentrationem proteini 2.5 mg ml-1 (analysis Bio-Rad). Processus ulterius peractus est ex methodo antea publicata (54), incipiens a dilutione 50 μg proteini in summam 50 μl TEAB continentis 1% (w/v) natrii laurati (Merck, UK). Post sonicationem per 60 secundas, redactum est cum 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphino (Merck, UK) ad 37°C per 30 minuta. Ad S-alkylationem, incuba exemplum cum 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonato (Merck, UK) et adde ex solutione 200 mM isopropanoli per 10 minuta ad temperaturam ambientem. Digestio proteolytica peracta est addendo 2 μg mixturae trypsini/endoproteinasis Lys-C (Promega UK) et incubata est ad 37°C per 3 horas. Tensioactiva laurata extracta est addendo 50 μl ethyl acetatis et 10 μl acidi trifluoroacetici 10% (v/v) gradus LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) et agitando per 60 secundas. Separatio phasium promota est centrifugatione ad 15,700 RCF per 5 minuta. Secundum protocollum fabricatoris, columna rotatoria C18 (Thermo Fisher Scientific, Britannia) adhibita est ad diligenter aspirandam et desaltam phasim inferiorem continentem peptidum. Post exsiccationem per centrifugationem vacui, exemplum dissolutum est in 0.5% TFA et 3% acetonitrilo, et 500 ng analysata sunt per chromatographiam nanoflow RP coniunctam cum spectrometria massae utens parametris systematis antea descriptis.
Ad identificationem et quantificationem proteinorum, programmate MaxQuant v.1.5.3.30 (56) utere ut in basi datorum proteomica Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) quaeras. Data proteomica spectrometriae massae in ProteomeXchange Alliance per repositorium sociorum PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sub identificatore datarum PXD020402 deposita sunt.
Ad analysin per RPLC cum spectrometria massae ionizationis electrospray coniunctam, complexus RC-LH1 ex Rps typo naturali praeparatus est. Methodo antea publicata (16) adhibita, concentratio proteini in cellulis palustris producta erat 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl et 0.03% (w/v) β- (analysis Bio-Rad)) DDM. Secundum protocollum fabricatoris, apparatum purificationis 2D (GE Healthcare, USA) ad extrahendum 10 μg proteini methodo praecipitationis, et praecipitatum dissolvendum in 20 μl 60% (v/v) acidi formici (FA), 20% (v/v) Acetonitrili et 20% (v/v) aquae. Quinque microlitra per RPLC (Dionex RSLC) cum spectrometria massae (Maxis UHR-TOF, Bruker) coniuncta analysata sunt. Ad separationem ad 60°C et 100μlmin⁻¹, columna MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) adhibenda est, cum gradiente ab 85% (v/v) solvente A [0.1% (v/v) FA et 0.02% (V/v) solutione aquosa TFA] ad 85% (v/v) solvente B [0.1% (v/v) FA et 0.02% (v/v) in 90% (v/v) acetonitrilo TFA]. Utendo fonte ionizationis electrospray normali et parametris implicitis per plus quam 60 minuta, spectrometer massae 100 ad 2750 m/z (proportio massae ad caricam) obtinet. Auxilio instrumenti FindPept portae bioinformaticae ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), spectrum massae ad subunitates complexus mappa.
Cellulae sub luce 100 ml NF-humili (10μMm-2 s-1), media (30μMm-2 s-1) vel alta (300μMm-2 s-1) per horas 72 creverunt. Medium M22 (medium M22 in quo ammonium sulfas omittitur et succinas natrii acetato natrii substituitur) in ampulla 100 ml operculo cochleato (23) collectum est. In quinque cyclis 30 secundorum, globuli vitrei 0.1 micron, proportione voluminis 1:1, ad cellulas lysandas insculpti sunt et in glacie per 5 minuta refrigerati. Materia insolubilis, cellulae integrae et globuli vitrei centrifugatione ad 16,000 RCF per 10 minuta in microcentrifuga mensali remoti sunt. Membrana in rotore Ti 70.1 cum 100,000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) et gradiente saccharosi 40/15% (w/w) per 10 horas separata est.
Ut in opere nostro priori descriptum est, immunodetectio notae His in PufW (16). Breviter, complexus centralis purificatus (11.8 nM) vel membrana eandem concentrationem RC continens (determinata per oxidationem subtrahendo spectrum differentiae reductae et onus in gel tincto aequando) in 2x SDS loading buffer (Merck, UK) bis diluto. Proteina separata sunt in replica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel tinctum est Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ad subunitatem RC-L onerandam et visualizandam. Proteina in secundo gel translata est ad membranam polyvinylidene fluoridi (PVDF) methanolo-activatam (Thermo Fisher Scientific, UK) ad immunoassay. Membrana PVDF in 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 et 5% (w/v) lactis pulveris exempti obstructa est, deinde cum anticorpore primario anti-His (in solutione anticorporis tamponata diluta [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl et 0.05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) per quattuor horas incubata est. Post lavacrum ter per quinque minuta in liquore anticorporum, membrana cum anticorpore secundario anti-murino ex peroxidasa armoraciae rusticanae (Sigma-Aldrich, UK) (diluto 1:10,000 in liquore anticorporum) mixta est. Ad detectionem permittendam (quinque minuta post tres lavacra in liquore anticorporum) incubanda est, substrato chemiluminescenti WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) et Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) utens.
Delineando distributionem intensitatis cuiusque geli tincti vel lineae immuno-experimenti, integrando aream sub apice et calculando rationem intensitatis RC-L (gel tinctum) et Protein-W (immuno-experimento), in ImageJ (57) imaginem elabora. Hae rationes in rationes molares conversae sunt assumendo rationem RC-L ad protein-W in puro exemplo RC-LH114-W esse 1:1 et totum datorum fasciculum proinde normalizando.
Pro materiis supplementis ad hunc articulum, vide quaeso http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Hic est articulus libere accessibilis, sub condicionibus Licentiae Attributionis Creative Commons distributus. Articulus usum, distributionem, et reproductionem sine restrictionibus in quolibet medio permittit, dummodo opus originale rite citetur.
Nota: Solum rogamus ut inscriptionem electronicam tuam praebeas, ut persona quam paginae commendas sciat te velle eam videre epistulam et eam non esse spam. Nullas inscriptiones electronicas capemus.
Haec quaestio adhibetur ad explorandum utrum sis visitator et ad prohibendam submissionem automaticam epistularum inutilium.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philippus J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elisabetha C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Marcus J. Dickman, Dewey Holten, Christina Kirmaier, Andreas Hitchcock, C. Neil Hunter
Structura altae resolutionis complexus laquei lucis 1 in centro reactionis novas perspicientias in dynamicas quinonis praebet.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philippus J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elisabetha C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Marcus J. Dickman, Dewey Holten, Christina Kirmaier, Andreas Hitchcock, C. Neil Hunter
Structura altae resolutionis complexus laquei lucis 1 in centro reactionis novas perspicientias in dynamicas quinonis praebet.
©2021 American Associationis ad profectum Scientiae. omnia iura reservata. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et CONTRA. ISSN 2375-2548.