Praesens *Inscriptio praesens: Colonia Agrippina 50931, Germania, Colonie Excellenty Cluster Research on Cellular Stress Response in Senectute-related Diseases (CECAD).
Neurodegeneratio morborum mitochondrialium irreversibilis habetur quia plasticitas metabolica neuronorum limitata est, sed effectus dysfunctionis mitochondrialis in autonomiam cellularem metabolismi neuronalis in corpore parum intellegitur. Hic, proteoma cellulae specifica neuronorum Purkinje cum defectu OXPHOS progressivo, causato a dynamica fusionis mitochondrialis perturbata, introducimus. Invenimus dysfunctionem mitochondrialem mutationem profundam in campo proteomicae excitasse, quae tandem ad activationem sequentialem programmatum metabolicorum accuratorum ante mortem cellularem duxit. Inopinato, inductionem manifestam pyruvati carboxylasis (PCx) et aliorum enzymorum anti-senescentiae, quae intermedia cycli TCA supplent, determinavimus. Inhibitio PCx accentum oxidativum et neurodegenerationem exacerbavit, indicando atherosclerosis effectum protectivum habere in neuronis OXPHOS carentibus. Restauratio fusionis mitochondrialis in neuronibus terminaliter degeneratis has proprietates metabolicas omnino invertit, ita mortem cellularem prohibens. Nostrae inventiones vias antea ignotas, quae resistentiam dysfunctioni mitochondriali conferunt, identificant et ostendunt neurodegenerationem reverti posse etiam in stadiis posterioribus morbi.
Munus centrale mitochondriorum in metabolismo energiae neuronali conservando amplificatur per symptomata neurologica ampla quae cum morbis mitochondrialibus humanis consociantur. Plerique horum morborum causantur mutationibus geneticis quae expressionem genorum mitochondrialium regulant (1, 2) vel destructione genetica ad dynamicam mitochondrialem pertinenti, quae indirecte stabilitatem DNA mitochondrialis (mtDNA) afficiunt (3, 4). Opera in exemplaribus animalibus demonstraverunt vias metabolicas conservativas (5-7) in responsione ad dysfunctionem mitochondrialem in textibus circumstantibus activari posse, quod informationem magni momenti praebet ad profundam comprehensionem pathogenesis harum morborum complexorum. Contra, nostra comprehensio mutationum metabolicarum specificorum generum cellularum, quae a generali defectu productionis adenosini triphosphatis (ATP) mitochondrialis cerebri causantur, fundamentalis est (8), necessitatem identificandi scopos therapeuticos qui ad morbos prohibendos vel prohibendos adhiberi possunt, neurodegenerationem prohibentes (9) sublineans. Defectus informationis ex eo oritur quod cellulae nervosae late habentur flexibilitatem metabolicam valde limitatam habere comparatae cum generibus cellularum textuum circumstantium (10). Cum hae cellulae partes centrales agant in coordinando suppletione metabolitorum ad neurona, ut transmissionem synapticam promoveant et ad condiciones iniuriarum et morborum respondeant, facultas metabolismum cellulare ad condiciones difficiles textus cerebri adaptandi fere ad cellulas gliales limitatur (11-14). Praeterea, heterogeneitas cellularis innata textus cerebri studium mutationum metabolicarum, quae in specificis subgregibus neuronalibus fiunt, magnopere impedit. Propterea, parum de exactis consequentiis cellularibus et metabolicis dysfunctionis mitochondrialis in neuronis notum est.
Ut consequentias metabolicas dysfunctionis mitochondrialis intellegeremus, neurona Purkinje (PN) in variis stadiis neurodegenerationis, quae a destructione fusionis membranae externae mitochondrialis (Mfn2) causantur, segregavimus. Quamquam mutationes Mfn2 in hominibus cum forma neuropathiae sensoriae motoriae hereditariae, quae Charcot-Marie-Tooth typus 2A (15) appellatur, consociantur, destructio conditionalis Mfn2 in muribus methodus inductionis dysfunctionis oxidationis et phosphorylationis (OXPHOS) bene agnita est. Varii subtypi neuronales (16-19) et phaenotypus neurodegenerativus inde ortus symptomata neurologica progressiva, ut perturbationes motus (18, 19) vel ataxia cerebellaris (16), comitantur. Utentes combinatione proteomicae quantitativae sine notis (LFQ), metabolomicae, imaginum, et methodorum virologicarum, demonstramus neurodegenerationem progressivam pyruvatum carboxylasem (PCx) et alios factores in arteriosclerosi PN in vivo implicatos fortiter inducere. Expressione enzymorum. Ad momentum huius inventionis comprobandum, expressionem PCx in nucleis pulmonum (PN) Mfn2-carentibus specifice deminuimus, et invenimus hanc operationem accentum oxidativum aggravasse et neurodegenerationem accelerasse, ita demonstrantes azoospermiam morti cellulari conferre. Adaptabilitatem metabolicam. Severa expressio MFN2 degenerationem terminalem PN cum gravi defectu OXPHOS, consumptione ingenti DNA mitochondrialis, et rete mitochondriale apparente fracto omnino liberare potest, quod ulterius confirmat hanc formam neurodegenerationis etiam in stadio provecto morbi ante mortem cellularem recuperare posse.
Ut mitochondria in nucleis neuronorum (PN) sine Mfn2 visualizaremus, stirpem murinam usi sumus quae mitochondriis Cre-dependentibus permittit expressionem proteini fluorescentis flavi (YFP) (mtYFP) (20) Cre petere et morphologiam mitochondrialem in vivo examinavimus. Invenimus destructionem geni Mfn2 in PN ad divisionem gradatim reti mitochondrialis ducere (Figura S1A), et prima mutatio inventa est tribus hebdomadibus aetatis. Contra, degeneratio substantialis strati cellularum PN, ut demonstratur amissio immunocolorationis Calbindini, non coepit ante duodecimam hebdomadem aetatis (Figura 1, A et B). Discrepantia temporis inter primas mutationes in morphologia mitochondriali et initium visibile mortis neuronalis nos impulit ad investigandas mutationes metabolicas a dysfunctione mitochondriali ante mortem cellularem incitatas. Strategiam, quae in separatione cellularum fluorescentiae activatarum (FACS) fundatur, ad cellulas neuroblastomatas (PN) exprimentes YFP (YFP+) isolandas elaboravimus (Figura 1C), et in muribus comparationis (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP :: L7-cre), deinceps CTRL appellatas (Figura S1B). Optimizatio strategiae portae, secundum intensitatem relativam signi YFP, nobis permittit corpus YFP+ (YFPhigh) PN a non-PN (YFPneg) (Figura S1B) vel fragmentis fluorescentibus axonum/dendriticis putativis (YFPlow; Figura S1D, sinistra), purificare, microscopio confocali confirmatum (Figura S1D, dextra). Ad identitatem populationis classificatae verificandam, proteomicam LFQ et deinde analysin componentium principalium perfecimus, et invenimus separationem claram inter cellulas YFPhigh et YFPneg esse (Figura S1C). Cellulae YFPhigh locupletationem indicum PN notorum (e.g., Calb1, Pcp2, Grid2 et Itpr3) (21, 22) ostenderunt, sed nullam locupletationem proteinorum vulgo expressorum in neuronibus vel aliis generibus cellularum (Figura 1D). Comparatio inter exempla in cellulis YFPhigh classificatis collectis in experimentis independentibus coefficientem correlationis > 0.9 ostendit, bonam reproducibilitatem inter replicata biologica demonstrans (Figura S1E). In summa, haec data consilium nostrum pro isolatione acuta et specifica PN possibilium validavit. Quia systema impulsoris L7-cre adhibitum recombinationem mosaicam in prima hebdomade post partum inducit (23), mures ex CTRL et conditionalibus (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neurones colligere coepimus. Postquam recombinatio completa est, Mfn2cKO appellatur ad quattuor hebdomades aetatis. Ut punctum finale, octo hebdomades aetatis elegimus cum stratum PN integrum erat, quamvis manifesta fragmentatione mitochondriali (Figura 1B et Figura S1A). In summa, 3013 proteinas quantificavimus, quarum circiter 22% in annotationibus MitoCarta 2.0, proteomate mitochondriali ut mitochondriis innixis, fundatae sunt (Figura 1E) (Figura 1E) (24). Analysis differentialis expressionis genicae, hebdomade 8 peracta, ostendit tantum 10.5% omnium proteinorum mutationes significantes habuisse (Figura 1F et Figura S1F), quarum 195 proteinae deminutae et 120 proteinae sursum regulatae sunt (Figura 1F). Notandum est "analysim viarum innovativam" huius datorum demonstrare gena differentialiter expressa plerumque ad coetum restrictum viarum metabolicarum specificarum pertinere (Figura 1G). Curiose, quamquam deminutio viarum ad OXPHOS et signalationem calcii pertinentium inductionem dysfunctionis mitochondrialis in nucleotidis pulmonalibus (PN) fusione carentibus confirmat, aliae categoriae quae praecipue metabolismum aminoacidorum includunt significanter sursum regulatae sunt, quod congruit cum metabolismo qui in PN mitochondrialibus fit. Reconnexiones constanse fiunt.
(A) Photographiae confocales repraesentativae sectionum cerebellarium murium CTRL et Mfn2cKO, ostendentes iacturam progressivam nucleorum partium cellularum (calbindinum, griseum); nuclei contratincti sunt cum DAPI. (B) Quantificatio (A) (analysis variantiae unidirectionalis, ***P<0.001; n = 4 ad 6 circuli ex tribus muribus). (C) Fluxus operis experimentalis. (D) Distributio mappae caloris signorum specificorum Purkinje (summum) et aliorum generum cellularum (medium). (E) Diagramma Venn ostendens numerum proteinorum mitochondrialium identificatorum in PN classificata. (F) Diagramma vulcanicum proteinorum differentialiter expressorum in neuronibus Mfn2cKO ad 8 hebdomades (limen significationis 1.3). (G) Analysis viae creativitatis ostendit quinque vias regulationis sursum (rubras) et regulationis deorsum (caeruleas) maximi momenti in PN Mfn2cKO classificata ut 8 hebdomades. Gradus expressionis medius cuiusque proteini detecti ostenditur. Mappa caloris grisea: valor P adaptatus. ns, non magni momenti.
Data proteomica demonstraverunt expressionem proteinorum complexuum I, III, et IV gradatim decrevisse. Complexus I, III, et IV omnes subunitates essentiales mtDNA-codificatas continebant, dum complexus II, qui solum nucleo-codificatus erat, plerumque immutatus erat (Figura 2A et Figura S2A). Congruenter cum resultatis proteomicis, immunohistochemia sectionum textus cerebellaris ostendit gradum subunitatis MTCO1 (subunitas 1 cytochromatis C oxidasis mitochondrialis) complexus IV in PN gradatim decrevisse (Figura 2B). Subunitas Mtatp8 mtDNA-codificata significanter redacta est (Figura S2A), dum gradus status stabilis subunitatis ATP synthase nucleo-codificatae immutatus mansit, quod congruit cum noto complexu F1 subassemblationis ATP synthase stabilis cum expressio mtDNA stabilis est. Formatio constans est. Interruptio (7). Aestimatio gradus mtDNA in nucleotidis particulis (PN) Mfn2cKO ordinatis per reactionem concatenationis polymerasis in tempore reali (qPCR) confirmavit decrementum gradatim numeri exemplarium mtDNA. Comparatum cum grege testigo, aetate octo hebdomadarum, tantum circiter 20% gradus mtDNA retenta est (Figura 2C). His resultatis congruenter, tinctio microscopica confocalis PN Mfn2cKO adhibita est ad DNA detegendum, consumptionem nucleotidorum mitochondrialium tempore dependentem ostendens (Figura 2D). Invenimus tantum nonnullos candidatos implicatos in degradatione proteinorum mitochondrialium et responsione ad stress auctos esse, inter quos Lonp1, Afg3l2 et Clpx, et factores assemblationis complexus OXPHOS. Nullae mutationes significantes in gradibus proteinorum implicatorum in apoptosi detectae sunt (Figura S2B). Similiter, invenimus canales mitochondriales et reticuli endoplasmatici implicatos in transportatione calcii tantum mutationes minores habere (Figura S2C). Praeterea, aestimatio proteinorum autophagiae conexorum nullas mutationes significantes invenit, quod congruit cum inductione visibili autophagosomatum in vivo observata per immunohistochemiam et microscopiam electronicam (Figura S3). Attamen, dysfunctio OXPHOS progressiva in nucleis paraenocyticis (PN) comitatur mutationibus mitochondrialibus ultrastructuralibus manifestis. Coetus mitochondriales videri possunt in corporibus cellularibus et arboribus dendriticis PN Mfn2cKO aetatis 5 et 8 hebdomadarum, et structura membranae internae mutationes profundas subiit (Figura S4, A et B). Congruenter cum his mutationibus ultrastructuralibus et diminutione significativa in mtDNA, analysis segmentorum cerebri cerebellarium acutorum cum tetramethylrhodamini methyl estere (TMRM) demonstravit potentialem membranae mitochondrialis in PN Mfn2cKO significanter diminutum esse (Figura S4C).
(A) Analysis temporis expressionis complexus OXPHOS. Solum proteinas cum P<0.05 ad 8 hebdomades considera (ANOVA bidirectionalis). Linea punctata: Nulla adaptatio comparata cum CTRL. (B) Sinistra: Exemplum sectionis cerebellaris anticorpore anti-MTCO1 signatae (scalae lineae, 20 μm). Area corporibus cellularum Purkinje occupata flavo tegitur. Dextra: Quantificatio graduum MTCO1 (analysis variantiae unidirectionalis; n = 7 ad 20 cellulae ex tribus muribus analysatae). (C) Analysis qPCR numeri exemplarium mtDNA in PN ordinato (analysis variantiae unidirectionalis; n = 3 ad 7 mures). (D) Sinistra: Exemplum sectionis cerebellaris anticorpore anti-DNA signatae (scalae lineae, 20 μm). Area corporibus cellularum Purkinje occupata flavo tegitur. Dextra: Quantificatio laesionum mtDNA (analysis variantiae unidirectionalis; n = 5 ad 9 cellulae ex tribus muribus). (E) Exemplum sectionis cerebellaris acutae ostendens cellulas mitoYFP + Purkinje (sagitta) in inscriptione patch clamp cellulae integrae. (F) Quantificatio curvae IV. (G) Inscriptiones repraesentativae injectionis currentis depolarizantis in cellulis Purkinje CTRL et Mfn2cKO. Vestigium superius: Primus impulsus qui PA excitavit. Vestigium inferius: Frequentia maxima PA. (H) Quantificatio inputuum spontaneorum postsynapticorum (sPSPs). Vestigium inscriptionis repraesentativum et eius proportio zoom in (I) monstrantur. Analysis variantiae unidirectionalis analysata est n = 5 ad 20 cellulas ex tribus muribus. Data exprimuntur ut media ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Vestigia repraesentativa PA spontanea inscriptionata utens modo patch clamp perforato. Vestigium superius: Frequentia maxima PA. Vestigium inferius: zoom unius PA. (K) Quantifica frequentiam mediam et maximam PA secundum (J). Examen Mann-Whitney; n = 5 cellulae ex quattuor muribus analysatae sunt. Data exprimuntur ut media ± SEM; non magni momenti.
Manifestum damnum OXPHOS in neuroblastomate Mfn2cKO octo hebdomadarum nato detecta est, quod indicat functionem physiologicam neuronorum graviter abnormalem esse. Quapropter, proprietates electricas passivas neuronorum OXPHOS carentium post quattuor ad quinque hebdomadas et septimam ad octo hebdomadas per inscriptiones "patch clamp" cellularum integrarum in segmentis cerebellaribus acutis effecimus (Figura 2E). Inopinato, potentiale membranae quiescentis medium et resistentia input neuronorum Mfn2cKO similes erant ac in grupo controlli, quamquam differentiae leves inter cellulas erant (Tabula 1). Similiter, post quattuor ad quinque hebdomadas aetatis, nullae mutationes significantes in relatione currentis-voltii (curva IV) inventae sunt (Figura 2F). Nihilominus, nulli neuroni Mfn2cKO septem ad octo hebdomadarum nati regimen IV (gradus hyperpolarizationis) supervixerunt, quod indicat sensibilitatem manifestam ad potentiale hyperpolarizationis in hoc stadio sero esse. Contra, in neuronibus Mfn2cKO, currentes depolarizantes qui repetitivas actionis potentialis (PA) emissiones efficiunt bene tolerantur, quod indicat eorum generales emissionum exemplaria non significanter differre ab illis neuronorum octo hebdomadarum natorum (Tabula 1 et Figura 2G). Similiter, frequentia et amplitudo currentium postsynapticorum spontaneorum (sPSCs) comparabiles erant cum illis gregis controlli, et frequentia eventuum aucta est a 4 hebdomadibus ad 5 hebdomades ad 7 hebdomades ad 8 hebdomades cum simili incremento (Figura 2, H et I). Periodus maturationis synapticae in PNs (25). Similia eventus obtenta sunt post emplastra PN perforata. Haec configuratio impedit possibilem compensationem defectuum cellularium ATP, ut fieri potest in inscriptione patch clamp cellulae integrae. Praesertim, potentia membranae quiescentis et frequentia emissionis spontaneae neuronorum Mfn2cKO non affecta sunt (Figura 2, J et K). Summa summarum, haec eventa indicant neuroblastomata primaria cum manifesta dysfunctione OXPHOS bene cum exemplaribus exonerationis altae frequentiae tolerare posse, quod indicat mechanismum compensationis esse qui eis permittit responsa electrophysiologica prope normales conservare.
Data exprimuntur ut media ± SEM (analysis variantiae unidirectionalis, probatio comparationis multiplicis Holm-Sidak; *P<0.05). Numerus unitatis indicatur uncinis.
Investigare propositum nostrum erat num ulla categoria in indice proteomicorum (Figura 1G) vias includat quae defectum OXPHOS gravem resistere possint, ita explicans cur neuropatia parva affecta electrophysiologiam prope normalem servare possit (Figura 2, E ad K). Analysis proteomica demonstravit enzyma implicata in catabolismum aminoacidorum catenae ramosae (BCAA) significanter aucta esse (Figura 3A et Figura S5A), et productum finale acetyl-CoA (CoA) vel succinyl CoA tricarboxylata in cyclo acidi arteriosclerosis (TCA) supplere posse. Invenimus contentum transaminasis BCAA 1 (BCAT1) et BCAT2 utroque auctum esse. Hae primum gradum catabolismi BCAA catalyzant glutamatum ex α-ketoglutarato generando (26). Omnes subunitates quae complexum cetoacidi dehydrogenasis catenae ramosae (BCKD) constituunt, auctae sunt (complexus decarboxylationem subsequentem et irreversibilem sceleti carbonici BCAA resultantis catalysat) (Figura 3A et Figura S5A). Nihilominus, nullae mutationes manifestae in ipso BCAA in PN ordinatis inventae sunt, quod fortasse ob auctam absorptionem cellularem horum aminoacidorum essentialium vel ob usum aliarum fontium (glucosi vel acidi lactici) ad cyclum TCA supplendum debetur (Figura S5B). PN carentes OXPHOS etiam auctas actiones decompositionis glutamini et transaminationis ad octo septimanas aetatis ostenderunt, quod per auctam regulationem enzymorum mitochondrialium glutaminasis (GLS) et glutamini pyruvatis transaminasis 2 (GPT2) reflecti potest (Figura 3, A et C). Notandum est augmentum GLS ad isoformam glutaminasis C (GLS-GAC) per splicem limitatam esse (mutatio Mfn2cKO/CTRL circiter 4.5-plicata est, P = 0.05), et eius augmentum specificum in textibus cancri bioenergiam mitochondrialem sustinere posse. (27)
(A) Tabula caloris mutationem multiplicem in gradu proteini pro via specificata post 8 hebdomades ostendit. (B) Exemplum segmenti cerebellaris anticorpore anti-PCx signati (scalae lineae, 20 μm). Sagitta flava corpus cellulae Purkinje indicat. (C) Analysis expressionis proteini per tempus identificata ut candidatus magni momenti pro atherosclerosi (t-test multiplex, *FDR <5%; n = 3-5 mures). (D) Supra: Diagramma schematicum ostendens modos diversos ingrediendi carbonium signatum contentum in indicatore [1-13C]pyruvato (i.e., per PDH vel viam trans-arterialem). Imum: Charta violina ostendit percentationem carbonii singulariter signati (M1) conversi in acidum asparticum, acidum citricum et acidum malicum post signationem segmentorum cerebellarium acutorum [1-13C]pyruvato (t-test par; ** P <0.01). (E) Analysis historiae temporalis comprehensiva viae indicatae. Solum considera proteinas cum P<0.05 post 8 hebdomades. Linea punctata: nulla valor correctionis (analysis variantiae bidirectionalis; * P < 0.05; *** P < 0.001). Data exprimuntur ut media ± SEM.
In nostra analysi, catabolismus BCAA una ex praecipuis viis augmentationis facta est. Hoc vehementer suggerit volumen ventilationis in cyclum TCA ingrediens mutari posse in PN carentibus OXPHOS. Hoc fortasse formam maiorem refectionis metabolicae neuronalis repraesentat, quae impulsum directum in physiologiam neuronalem et superviventiam habere potest dum dysfunctio OXPHOS severa conservatur. Congruenter cum hac hypothesi, invenimus principale enzymum anti-atheroscleroticum PCx augmentationi regulatum esse (Mfn2cKO/CTRL mutatur circiter 1.5 vicibus; Figura 3A), quod conversionem pyruvati ad oxaloacetatum (28) catalysat, quod in tela cerebri esse creditur. Expressio in [insert translation] ad astrocytos restringitur (29, 30). Congruenter cum resultatis proteomicis, microscopia confocalis demonstravit expressionem PCx specifice et significanter auctam esse in PN carentibus OXPHOS, dum reactivitas PCx praecipue ad cellulas gliales Bergmann adiacentes controlli restricta erat (Figura 3B). Ad functione explorandam augmentum PCx, segmenta cerebellaria acuta cum indicatore [1-13C]pyruvato tractavimus. Cum pyruvatum a pyruvato dehydrogenasa (PDH) oxidatum est, eius notatio isotopica evanuit, sed in intermedia cycli TCA incorporatur cum pyruvatum per reactiones vasculares metabolizatur (Figura 3D). Ad confirmanda nostra data proteomica, magnum numerum indicatorum ex hoc indicatore in acido aspartico segmentorum Mfn2cKO observavimus, dum acidum citricum et acidum malicum etiam moderatam inclinationem, quamquam non significantem, ostenderunt (Figura 3D).
In neuronibus dopaminicis murium MitoPark cum dysfunctione mitochondriali causata a neuronis dopaminicis genum factoris transcriptionis mitochondrialis A (Tfam) specifice destruentibus (Figura S6B), expressio PCx etiam significanter aucta est (31), indicando eventum morbi arteriosclerosis acidi acetonici regulari per dysfunctionem OXPHOS neuronalis in corpore. Notandum est inventum esse enzyma singularia (32-34) quae in neuronibus quae cum arteriosclerosi coniungi possunt exprimi possunt significanter aucta esse in nucleis pulmonalibus (PN) carentibus OXPHOS, ut propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA propionyl-CoA in succinyl-CoA convertit, et enzymum malicum mitochondriale 3 (ME3), cuius munus principale est pyruvatum a malato recuperare (Figura 3, A et C) (33, 35). Praeterea, augmentum significans in enzymo Pdk3, quod PDH phosphorylat et sic inactivat, invenimus (36), dum nullae mutationes in enzymo Pdp1, quod PDH activat, vel in ipso complexo enzymico PDH detectae sunt (Figura 3A). Constanter, in nucleis parietum Mern2cKO, phosphorylatio subunitatis α1 α (PDHE1α) componentis pyruvati dehydrogenasis E1 complexi PDH in Ser293 (notum est activitatem enzymicam PDH inhibere) aucta est (Figura S6C) (Figura S6C). Pyruvatum nullum accessum vascularem habet.
Denique invenimus viam optimam biosynthesis serinae et glycinae, cyclum folati mitochondrialis (1C) conexum, et biosynthesis prolinae (Figura 1G et Figura S5C) omnes significanter auctas esse, secundum relationes, durante processu activationis. Textus circumstantes cum dysfunctione mitochondriali activantur (5-7). Analysis confocalis, haec data proteomica sustinens, ostendit in neuropatia pulmonali (PN) cum OXPHOS absente, segmenta cerebellaria murium octo hebdomadarum serinae hydroxymethyltransferasi 2 (SHMT2), enzymo clavi cycli folati mitochondrialis, subiecta esse. Responsio immunis significativa (Figura S5D). In tredecim segmentis cerebellaribus acutis incubatis CU-glucoso, experimenta vestigationis metabolicae ulterius confirmaverunt auctam regulationem biosynthesis serinae et prolinae, indicantes fluxum isoformarum carbonii in serinam et prolinam auctum esse (Figura S5E). Cum reactiones a GLS et GPT2 promotae synthesin glutamati ex glutamino et transaminationem inter glutamatum et α-ketoglutaratum efficiant, earum augmentatio indicat neurones OXPHOS-carentes auctum glutamati postulationem habere. Hoc fortasse ad conservandam auctam biosynthesis prolini spectat (Figura S5C). Contra has mutationes, analysis proteomica astrocytorum cerebellarium ex muribus Mfn2cKO PN-specificis demonstravit has vias (inclusis omnibus antiperoxidasis) in expressione significanter non mutasse, ita demonstrans hanc redirectionem metabolicam selectivam esse ad PN degradatam (Figura S6, D ad G).
Summa summarum, hae analyses significanter diversas formas activationis temporalis specificarum viarum metabolicarum in nucleis neuronalibus (PN) revelaverunt. Quamquam functio mitochondrialis neuronalis abnormalis ad atherosclerosis praecocem et remodellationem 1C (Figura 3E et Figura S5C) ducere potest, et etiam mutationes praedicabiles in expressione complexuum I et IV, mutationes in synthesi serinae de novo tantum in posterioribus stadiis apparentes factae sunt. Dysfunctio OXPHOS tantum in posterioribus stadiis (Figura 3E et Figura S5C) apparet. Haec inventa processum sequentialem definiunt in quo mitochondria (cyclus 1C) et cytoplasmatica (biosynthesis serinae) a stress inducta synergistice cum incremento atherosclerosis in cyclo TCA respondent ad metabolismum neuronalem reformandum.
Cellulae pulmonales (PN) octo hebdomadarum, OXPHOS carentes, excitationis frequentiae altae excitationis activitatem conservare et metabolicam reconnexionem significantem subire possunt ad dysfunctionem mitochondrialem compensandam. Haec inventio possibilitatem interesantem excitat, etiam hoc tempore hae cellulae interventionem therapeuticam ad neurodegenerationem tardandam vel prohibendam recipere possint. Hanc possibilitatem per duas interventiones independentes resolvimus. In prima methodo, vectorem virus adeno-associatum (AAV) Cre-dependentem designavimus ut MFN2 selective exprimi possit in vivo in PN OXPHOS carentibus (Figura S7A). AAV MFN2 codificans et gen nuntiatorium fluorescens mCherry (Mfn2-AAV) in culturis neuronorum primariis in vitro verificati sunt, quod effecit ut MFN2 modo Cre-dependenti exprimeretur et morphologiam mitochondrialem servavit, ita neuromutationem in neuronibus Mfn2cKO impediens (Figura S7, B, D et E). Deinde, experimenta in vivo effecimus ut stereotactice Mfn2-AAV octo hebdomadarum natum cortici cerebellari murium Mfn2cKO et murium comparationis traderemus, et mures duodecim hebdomadarum natos analyzavimus (Figura 4A). Mures Mfn2cKO tractati mortui sunt (Figura 1, A et B) (16). Transductio viralis in vivo expressionem selectivam PN in quibusdam circulis cerebellaribus effecit (Figura S7, G et H). Iniectio AAV comparationis solum mCherry exprimentis (Ctrl-AAV) nullum effectum significantem in gradum neurodegenerationis in animalibus Mfn2cKO habuit. Contra, analysis Mfn2cKO cum Mfn2-AAV transductorum effectum protectivum significantem strati cellularum PN ostendit (Figura 4, B et C). Praesertim, densitas neuronorum fere indistinguibilis ab animalibus comparationis videtur (Figura 4, B et C, et Figura S7, H et I). Expressio MFN1, sed non MFN2, aeque efficax est in morte neuronali servanda (Figura 4C et Figura S7, C et F), quod indicat expressionem ectopici MFN1 posse efficaciter supplere carentiam MFN2. Ulterior analysis in gradu singularis neuroblastomata (PN) ostendit Mfn2-AAV magna ex parte ultrastructuram mitochondriorum servavisse, gradus mtDNA normalizavisse, et expressionem magnam signi anti-angiogenesis PCx ​​invertesse (Figura 4, C ad E). Inspectio visualis murium Mfn2cKO servatorum in statu quietis demonstravit eorum posturam et symptomata motoria (motus S1 ad S3) emendata esse. In conclusione, haec experimenta ostendunt reintroductionem tardam MFN2 in PN graviter carentes in OXPHOS sufficientem esse ad consumptionem mtDNA invertendam et atherosclerosim inducendam, ita degenerationem axonum et mortem neuronalem in vivo prohibens.
(A) Schema ostendens ordinem experimentalem iniectionis AAV MFN2 codificantis cum via metabolica indicata activatur. (B) Imagines confocales repraesentativae segmentorum cerebellarium 12 hebdomadarum transductorum ad 8 hebdomadas in muribus Mfn2cKO et notatorum cum anticorpore anti-Calbindin. Dextra: Scalatio fibrarum axonum. Scala zoom axonum est 450 et 75 μm. (C) Sinistra: Quantificatio densitatis cellularum Purkinje in ansa transductionis AAV (AAV+) (analysis variantiae unidirectionalis; n = 3 mures). Dextra: Analysis foci mtDNA in PN transducta ad hebdomadam 12 (test t impar; n = 6 cellulae ex tribus muribus). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Micrographa electronica transmissionis repraesentativa PN sectionum cerebellarium Mfn2cKO transductarum cum vectoribus viralibus indicatis. Persona rosea aream a dendritis occupatam illustrat, et quadratum flavum punctatum amplificationem a dextra datam illustrat; n nucleum repraesentat. Scalae linea, 1 μm. (E) exemplum tinctionis PCx in PN transducta post 12 septimanas ostendit. Scalae linea, 20 μm. OE, superexpressio; FC, mutatio plicae.
Denique, momentum superviventiae cellularum peroxidasa inductae in nucleis pulmonum (PN) quae dysfunctionem OXPHOS expertae sunt investigavimus. Virus mCherry generavimus, AAV-shRNA (RNA brevis capillorum) codificans, mRNA PCx muris (AAV-shPCx) specifice petentem, et virus vel eius control confusum (AAV-scr) in cerebellum murium Mfn2cKO iniecimus. Iniectio quarta hebdomade aetatis peracta est (Figura 5A) ut efficax suppressio PCx per tempus quo expressio PCx augebatur (Figura 3C) et stratum cellularum PN adhuc integrum erat (Figura 1A) obtineretur. Notandum est suppressionem PCx (Figura S8A) ad accelerationem significantem mortis PN ducere, quae ad anulum infectum limitatur (Figura 5, B et C). Ut mechanismum effectuum metabolicorum ab augmentatione PCx inductorum intellegeremus, statum redox nucleotidorum particulorum (PN) post deminutionem PCx et biosensorem opticum Grx1-roGFP2, ab AAV mediatum, simul expressum investigavimus (Figura S8, B ad D) ut mutationem relativam potentialis redox peptidi glutathioni aestimaremus (38). Deinde, microscopiam imaginum fluorescentiae per totam vitam (FLIM) in segmentis cerebri acutis Mfn2cKO septem hebdomadarum vel sodalium stirpis moderatricis perfecimus ut mutationes potentiales in statu redox cytoplasmatico detegeremus post verificationem condicionum FLIM (Figura S8, E ad G). Analysis ostendit augmentum significantem in statu oxidationis singularum PN Mfn2cKO carentium expressione PCx, quod differt a neuronibus moderatricibus vel PN Mfn2cKO solum shRNA confusum exprimentibus (Figura 5, D et E). Cum expressio PCx deminuta est, proportio nucleotidorum nuclearium Mfn2cKO statum valde oxidatum ostendentium plus quam triplo aucta est (Figura 5E), quod indicat augmentationem PCx capacitatem redox neuronorum degeneratorum conservavisse.
(A) Schema ostendens ordinem experimentalem iniectionis AAV shPCx codificantis cum via metabolica indicata activatur. (B) Photographiae confocales repraesentativae sectionum cerebellarium octo hebdomadarum in muribus Mfn2cKO transductis et anticorpore anti-calcineurin post quattuor hebdomadas notatis. Scalae linea, 450μm. (C) Quantificatio densitatis cellularum Purkinje in ansis AAV-transductis (analysis variantiae unidirectionalis; n = 3 ad 4 mures). Data expressa sunt ut media ± SEM; ***P<0.001. (D) Imago FLIM repraesentativa ostendit spatium vitae medium sensoris redox glutathion Grx1-roGFP2 exprimentis PN septem hebdomadarum sub condicionibus experimentalibus specificatis. Ratio LUT (tabula inspicienda): intervallum temporis supervivendi (in picosecundis). Scalae linea, 25μm. (E) Histogramma distributionem valorum vitae Grx1-roGFP2 ab (D) ostendit (n=158 ad 368 cellulas in duobus muribus sub unaquaque conditione). Diagramma circulare supra unumquodque histogramma: numerum cellularum cum valoribus vitae significanter longioribus (rubris, oxidatis) vel brevioribus (caeruleis, reductis) ostendit, quae 1 deviationem standardem valoris vitae medii in CTRL-AAV-scr excedunt. (F) Exemplar propositum effectum protectivum augmentationis PCx neuronalis ostendit.
Summa summarum, data quae hic praebemus ostendunt reexpressionem MFN2 neuropathiam neuropathicam (NP) provectam cum gravi defectu OXPHOS, gravi depletione mtDNA, et morphologia ista-simili valde abnormali omnino salvare posse, ita progressum continuum etiam in morbis provectis praebens. Neurodegeneratio testimonium reversibile stadii ante mortem cellularem praebet. Hic gradus flexibilitatis metabolicae ulterius confirmatur facultate neuronorum atherosclerosis inducendi (reconfiguratio cycli TCA), quae expressionem PCx in NP carentibus OXPHOS inhibet et mortem cellularem amplificat, ita munus protectivum agens (Figura 5F).
In hoc studio, argumenta praebuimus responsum neuronorum pulmonalium (PN) ad dysfunctionem OXPHOS esse ut gradatim ad atherosclerosim cycli TCA per viam activationis differentialis a programmatibus metabolicis activatam convergant. Analysin proteomicam multis methodis complementariis confirmavimus et revelavimus neurones, cum a dysfunctione mitochondriali gravi provocati sint, formam elasticitatis metabolicae antea ignotam habere. Ad nostram admirationem, totus processus refectionis non necessario statum metabolicum terminalem, qui neurodegenerationem gradatim et irreversibiliter comitatur, significat, sed nostra data suggerunt eum neuronem sustentationis etiam in stadio ante mortem cellularum mechanismum compensationis functionalis constituere posse. Haec inventio indicat neurones gradum considerabilem plasticitatis metabolicae in corpore habere. Hoc factum probat reintroductionem posteriorem MFN2 expressionem signorum metabolicorum clavium invertere et degenerationem PN impedire posse. Immo, atherosclerosim inhibet et nervos transsexuales accelerat.
Inter inventiones nostrae investigationis maxime mirandas est quod neuroblastomata primaria (PN) OXPHOS carentia metabolismum cycli TCA modificare possunt per augmentum enzymorum quae arteriosclerosim specifice stimulant. Transordinatio metabolica est nota communis cellularum cancerosarum, quarum nonnullae glutamino nituntur ad intermedia cycli TCA supplementanda ad aequivalentes reducentes producendos, quae catenam respiratoriam impellunt et productionem praecursorum lipidorum et nucleotidorum biosynthesis conservant (39, 40). Studium recens demonstravit in textibus periphericis dysfunctionem OXPHOS experientibus, reconnexionem metabolismi glutamini/glutamati etiam notam prominentem esse (5, 41), ubi directio ingressus glutamini in cyclum TCA pendet propter gravitatem laesionis OXPHOS (41). Tamen, desunt clarae probationes de ulla similitudine plasticitatis metabolicae neuronalis in corpore et eius possibilis momenti in contextu morbi. In studio recenti in vitro, neurona corticalia primaria demonstrata sunt glomerationes glutamati pro neurotransmissione mobilizare, ita metabolismum oxidativum et atherosclerosim sub condicionibus stressis metabolici promoventes (42). Notandum est, sub inhibitione pharmacologica enzymi succinati dehydrogenasi cycli TCA, carboxylationem pyruvati credi posse synthesis oxaloacetati in neuronis granulorum cerebellarium cultis conservare (34). Attamen, momentum physiologicum horum mechanismorum ad textum cerebri (ubi atherosclerosis plerumque ad astrocytos limitata creditur) adhuc momentum physiologicum magnum habere (43). Hoc in casu, nostra data ostendunt neuroblastomata per OXPHOS in corpore laesa ad degradationem BCAA et carboxylationem pyruvati converti posse, quae duae fontes principales supplementationis intermediorum TCA sunt. Quamquam contributio putativa catabolismi BCAA ad metabolismum energiae neuronalis proposita est, praeter munus glutamati et GABA pro neurotransmissione (44), nullae adhuc sunt probationes horum mechanismorum in vivo. Ergo, facile est coniectare neuroblastomata dysfunctionalia posse sponte compensare consumptionem intermediorum TCA a processu assimilationis impulsorum per atherosclerosis augendam. Praesertim, augmentatio PCx fortasse requiritur ad auctum postulatum acidi aspartici conservandum, quod in cellulis proliferantibus cum dysfunctione mitochondriali suggeritur (45). Attamen, nostra analysis metabolomica nullas mutationes significantes in gradu status stabilis acidi aspartici in nucleis parvis (PN) Mfn2cKO (Figura S6A) revelavit, quod probabiliter diversam usum metabolicum acidi aspartici inter cellulas proliferantes et neuronas post-mitoticas reflectit. Quamquam exactus mechanismus augmentationis PCx in neuronis dysfunctionalibus in vivo adhuc describendus est, demonstravimus hanc responsionem praematuram munus magnum agere in conservando statu redox neuronorum, quod in experimentis FLIM in segmentis cerebellaribus demonstratum est. Praesertim, impedire PN ne PCx augeant potest ad statum magis oxidatum ducere et mortem cellularem accelerare. Activatio degradationis BCAA et carboxylatio pyruvati non sunt modi ad textus periphericos dysfunctionis mitochondrialis describendos (7). Ergo, videntur esse nota prioritaria neuronorum OXPHOS-deficientium, etiamsi non sola nota, quae magni momenti est pro neurodegeneratione. .
Morbus cerebellaris est genus heterogeneum morbi neurodegenerativi qui plerumque ut ataxia se manifestat et saepe nucleos pulmonum (PN) laedit (46). Haec populatio neuronum praecipue vulnerabilis est dysfunctioni mitochondriali quia degeneratio eorum selectiva in muribus sufficit ad reproducenda multa symptomata motoria quae ataxiam spinocerebellarem humanam designant (16, 47, 48). Secundum relationes, exemplar muri transgenicum cum gene mutante cum ataxia spinocerebellari humana coniungitur et dysfunctionem mitochondrialem habet (49, 50), quod momentum studendi consequentias defectus OXPHOS in PNPH confirmat. Ergo, praecipue aptum est hanc unicam populationem neuronum efficaciter isolare et studere. Attamen, cum PN valde sensibiles sint pressioni et parvam proportionem totius populationis cellularum cerebellarium constituant, multis studiis omicis fundatis, separatio selectiva earum ut cellularum integrarum adhuc est aspectus difficilis. Quamquam fere impossibile est absolutam absentiam contaminationis aliorum generum cellularum (praesertim textuum adultorum) assequi, efficax dissociationis gradum cum FACS coniunximus ut satis numerus neuronorum viabilium ad analysin proteomicam subsequentem obtineretur, et satis altam opertionem proteinorum (circiter 3000 proteinas) habemus comparatam cum exsistente collectione datorum totius cerebelli (51). Conservando vitalitatem cellularum integrarum, methodus quam hic praebemus non solum nobis permittit mutationes in viis metabolicis in mitochondriis inspicere, sed etiam mutationes in suis contrapartibus cytoplasmaticis inspicere, quod usum inscriptionum membranae mitochondrialis ad locupletandum genus cellulae complet. Nova methodus pro numero mitochondriorum in textibus complexis (52, 53). Methodus quam describimus non solum ad studium cellularum Purkinje pertinet, sed facile ad quodlibet genus cellulae applicari potest ad mutationes metabolicas in cerebris aegrotis tractandas, inter alia exempla dysfunctionis mitochondrialis.
Tandem, fenestram therapeuticam per hunc processum reordinationis metabolicae invenimus quae signa principalia tensionis cellularis omnino invertere et degenerationem neuronalem impedire potest. Ergo, intellegentia implicationum functionalium refectionis hic descriptae perspicientiam fundamentalem in curationes possibiles ad conservandam vitalitatem neuronalem per dysfunctionem mitochondrialem praebere potest. Investigationes futurae ad dissecandum mutationes in metabolismo energiae in aliis generibus cellularum cerebri spectantes necessariae sunt ut applicabilitatem huius principii ad alias morbos neurologicos plene revelent.
Mures MitoPark antea descripti sunt (31). Mures C57BL/6N cum genibus Mfn2 ad latera loxP antea descripti sunt (18) et cum muribus L7-Cre mixti (23). Progenies dupliciter heterozygota inde orta deinde cum muribus homozygotis Mfn2loxP/Mfn2loxP mixta est ad genes Purkinje-specificos Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) mutandos. In subparte copulationis, allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) per cruces additas introductum est (20). Omnes processus animalium secundum normas Europaeas, nationales et institutionales peracti sunt et a LandesamtfürNatur de Umwelt et Verbraucherschutz, Rhenania Septentrionalis-Vestfalia, Germania, probati sunt. Opus animale etiam normas Foederationis Europaeae Societatum Scientiarum Animalium Laboratorii sequitur.
Post anaesthesiam luxationis cervicis mulieris praegnantis, embryo muris segregatus est (E13). Cortex in Solutione Salsa Aequilibrata Hanks (HBSS) cum 10 mM Hepes addita dissectus et in Medium Dulbecco Modificatum Eagle continente papainum (20 U/ml) et cysteinum (1μg/ml) transmissus est. Textus in DMEM) incubatur et per digestionem enzymaticam (Ml) ad 37°C per 20 minuta dissociatur, deinde mechanice in DMEM cum 10% sero bovino fetali addito molitur. Cellulae in vitreis tegminibus polylysino obductis densitate 2×10⁶ per patellam culturae 6 cm vel densitate 0.5×10⁶ cellularum/cm² ad analysin imaginum seminatae sunt. Post 4 horas, medium medio Neurobasali sine sero continente 1% supplementum B27 et 0.5 mM GlutaMax substitutum est. Neurona deinde per totum experimentum ad 37°C et 5% CO2 conservata sunt, et semel in hebdomada pascebantur. Ad recombinationem in vitro inducendam, 3 μl (patina culturae 24 puteorum) vel 0.5 μl (lamina 24 puteorum) sequentis vectoris viralis AAV9 ad neurona die secundo in vitro tractanda adhibita sunt: ​​AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, numerus catalogi 105530-AAV9) et AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numerus catalogi 105545-AAV9).
DNA complementarium muris Mfn1 et Mfn2 (ex plasmide Addgene #23212 et #23213 respective obtentum) sequentia V5 (GKPINPLLGLDST) ad terminum C notatum est, et cum mCherry in quadro per sequentiam T2A coalefactum est. Grx1-roGFP2 donum est a Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Cassetta tdTomato per methodos clonationis consuetas substituta, cassetta in spinam principalem pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numerus referentiae Addgene 28306) subclonata est ad vectores pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 et pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 generandos. Similis ratio adhibita est ad vectorem moderatorium pAAV-CAG-FLEX-mCherry generandum. Ad constructum AAV-shPCx generandum, vector plasmidicus AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]) requiritur, qui sequentiam DNA continet quae shRNA PCx murinam (5′CTTTCGCTCTAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) dirigit, codificat. Sub imperio promotoris U6, mCherry sub imperio promotoris CMV adhibetur. Productio vectorum AAV auxiliarium secundum instructiones fabricatoris (Cell Biolabs) peracta est. Breviter, plasmide translationis portans genem mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) temporarie adhibeatur. Transfectio cellularum 293AAV -T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) vel Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) codificans, necnon plasmidis involucri proteinum capsidis AAV1 et proteinum accessorium codificans, methodo calcii phosphatis utens. Supernatans viralis crudum per cyclos congelationis-liquefactionis in balneo glaciei siccae/ethanoli obtentum est et cellulae in solutione salina tamponata phosphate (PBS) lysatae sunt. Vector AAV per ultracentrifugationem discontinuam gradientis iodixanoli (24 horas ad 32,000 rpm et 4°C) purificatus et concentratus est utens filtro centrifugo Amicon ultra-15. Titulus genomatis AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×10¹³ exemplar genomatis (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX sicut antea descriptum est (54), mensus est per PCR quantitativam in tempore reali (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×10¹³ GC/ml) et AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×10¹² GC/ml).
Neurona primaria in PBS glaciali 1x abrasa, in pellets divisa, deinde in 0.5% Triton X-100 / 0.5% natrii deoxycholati/PBS lysis buffer cum phosphatase et inhibitore proteasis (Roche) homogeneizata sunt. Quantificatio proteinorum peracta est utens examine acidi bicinchoninici (Thermo Fisher Scientific). Proteina deinde separata sunt per electrophoresin in gel SDS-polyacrylamidis, et deinde in membranam polyvinylidene fluoridi (GE Healthcare) immissa. Loca non specifica obstrue et cum anticorpore primario (vide Tabulam S1 pro singulis) in lacte 5% in TBST (solutione salina Tris-bufferata cum Tween), gradibus ablutionis et anticorpore secundario in TBST incuba. Cum anticorpore primario per noctem ad +4°C incuba. Post ablutionem, anticorpus secundarium per duas horas ad temperaturam ambientem applica. Deinde, eadem macula cum anticorpore anti-β-actin incubando, eadem onustio confirmata est. Detectio per conversionem ad chemiluminescentiam et amplificationem chemiluminescentiae (GE Healthcare).
Neurona antea in vitreis laminis tegentibus sparsa, tempore definito temperatura ambiente per decem minuta cum 4% paraformaldehydo (PFA)/PBS fixa sunt. Laminae tegentibus primum 0.1% Triton X-100/PBS per quinque minuta temperatura ambiente permeantur, deinde in liquore obstruente [3% albumine serico bovino (BSA)/PBS]. Die secundo, laminae liquore obstruente lavantur et cum anticorpore secundario fluorophoro-coniugato idoneo per duas horas temperatura ambiente incubantur; denique exempla in PBS cum 4′,6-diamidino-2-Phenylindolo (DAPI) diligenter lavata sunt, contratincta et deinde in lamina microscopici cum Aqua-Poly/Mount fixa sunt.
Muribus (maribus et feminis) anesthetizati sunt per injectionem intraperitonealem ketaminae (130 mg/kg) et xylazinae (10 mg/kg) et subcutanee administratum cum carprofeno analgesico (5 mg/kg), et in instrumento stereotactico (Kopf) cum pulvino calido positi. Cranium revelatum est et terebra dentalis adhibita est ad partem corticis cerebellaris ossi mis correspondentem (a lambda: cauda 1.8, lateralis 1, lobulis IV et V correspondens) tenuandam. Acu curva syringe utendum est ad foramen parvum in cranio caute creandum ne vascula infra perturbentur. Deinde capillare vitreum tenue extensum lente in microforamen inseritur (a -1.3 ad -1 in latere ventrali durae matris), et 200 ad 300 nl AAV in microiniectorem (Narishige) syringe manualibus (Narishige) pluries sub pressione humili per tempus 10 ad 20 minutorum iniicitur. Post infusionem, vas capillare per decem minutas amplius maneat ut virus plene diffundatur. Capillaribus extractis, cutis diligenter suitur ut inflammatio vulneris minuatur et animal convalescere possit. Animalia per aliquot dies post operationem analgeticis (caspofen) tractata sunt, quo tempore condicio eorum physica diligenter observata est, deinde tempore statuto euthanasia necata sunt. Omnes rationes secundum normas Europaeas, nationales et institutionales peractae sunt et a LandesamtfürNatur de Umwelt et Verbraucherschutz, Rhenania Septentrionalis-Vestfalia, Germania, probatae sunt.
Animalia ketamino (100 mg/kg) et xylazino (10 mg/kg) anesthetizata sunt, et cor primum PBS 0.1 M, deinde PFA 4% in PBS perfusum est. Textus dissectus et in PFA 4%/PBS per noctem ad 4°C fixatus est. Culter vibrans (Leica Microsystems GmbH, Vindobona, Austria) adhibitus est ad sectiones sagittales (50 μm crassas) ex cerebro in PBS fixo praeparandas. Nisi aliter specificatum est, tinctio sectionum libere natantium peracta est ut supra descriptum est (13) temperatura ambiente et agitatione. Breviter, primum, segmenta obtenta permeabilizata sunt Triton X-100/PBS 0.5% per 15 minuta temperatura ambiente; pro quibusdam epitopis (Pcx et Shmt2), segmenta in tris-EDTA tampone ad 80°C (PH 9) calefaciendo per 25 minuta loco huius gradus. Deinde, sectiones cum anticorpore primario (vide Tabulam S1) in liquore obstruente (3% BSA/PBS) ad 4°C per noctem sub agitatione incubatae sunt. Postero die, sectiones liquore obstruente lavatae et cum anticorpore secundario fluorophoro-coniugato idoneo per duas horas ad temperaturam ambientem incubatae sunt; denique, sectiones in PBS diligenter lavatae, DAPI contra-tinctae, et deinde AquaPolymount in lamella microscopii fixae sunt.
Microscopium confocale lasericum perlustrans (TCS SP8-X vel TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), lasere lucis albae et lasere ultraviolaceo diodorum 405 instructum, ad exemplum imaginandum adhibitum est. Excitando fluorophorum et signo cum Detectore Hybrido (HyDs) colligendo, programmate LAS-X adhibito sunt imagines congestae secundum exemplaria Nyquist in modo sequentiali colligendae: pro tabulis non quantitativis, signa valde dynamica sunt (exempli gratia, in cellulis somaticis et dendritis) (mtYFP) Adhibe HyD ad detegendum numerum PN in modo BrightR). Obturatio a 0.3 ad 6 ns adhibetur ad reducendum imaginem secundariam (fundum).
Imago in tempore reali cellularum ordinatarum. Post ordinationem in medio Neurobasal-A continenti 1% supplementum B27 et 0.5 mM GlutaMax, cellulae statim in laminas vitreas poly-l-lysino obductas (μ-Slide8 Well, Ibidi, numerus catalogi 80826) seminatae sunt, deinde ad 37°C et 5% CO2 per horam unam servatae sunt ut cellulae sedare possent. Imago in tempore reali peracta est in microscopio confocali laserico Leica SP8, instructo lasere albo, HyD, lente obiectiva olei 63×[1.4 apertura numerica (NA)] et scaena calefactionis.
Mus celeriter dioxido carbonii anesthetizatus et capite decollatus est, cerebrum celeriter a cranio remotum et in sectiones sagittales 200μm crassitudine (pro experimento notationis 13C) vel 275μm crassitudine (pro experimentis duorum photonum) dissectum, his materiis repletum. Glacies cremor (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) his substantiis repletum est: 125 mM liquore cerebrospinali artificiali (ACSF) NaCl glaciali, carbone saturato (95% O2 et 5% CO2), humilis Ca2, refrigerato, NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tamponato, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucoso, 0.5 mM CaCl2 et 3.5 mM MgCl2 (pressione osmotica 310 ad 330 mmol). Segmenta cerebri capta in cameram prae-incubationis continentem medium Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tamponatum, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosum, 1.0 mM CaCl2 et 2.0 mM MgCl2) pH 7.4 et 310 ad 320 mmol) transferantur.
Dum imagines captantur, segmenta in conclave imaginandi dedicatum mota sunt, et experimentum sub perfusione continua ACSF ad temperaturam constantem 32° ad 33°C peractum est. Microscopium lasericum multiphotonicum (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) lente obiectiva Leica 25x (NA 0.95, aqua) instructum, lasere Ti:Sapphirino (Chameleon Vision II, Coherent) adhibitum est ad delineationem segmentorum. Modulus FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Mutationes in statu redox cytoplasmatico nucleotidorum particulorum (PN) mensuratae sunt per FLIM duorum photonorum in segmentis sagittalibus cerebri, ubi biosensor Grx1-roGFP2 PN petivit. In strato PN, campus acquisitionis circiter 50 ad 80 μm infra superficiem segmenti eligitur ut PN viabilis sit (hoc est, absentia structurae globulosae vel mutationum morphologicarum neuronalium secundum dendritas) et sensor roGFP2 dupliciter positivus et AAV shRNA PCx vel eius sequentiam moderatricem codificantes (utraque mCherry co-exprimens). Imagines unius strati cum zoom digitali 2x colliguntur [undae undae excitationis: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Detectio: HyD interna, grex filtri fluorescein isothiocyanatis (FITC)] et media imaginum intra 2 ad 3 minuta adhibentur ut satis photonorum colligantur (1000 photonorum in summa) ad aptationem curvae. Sensibilitas specilli Grx1-roGFP2 et verificatio condicionum FLIM peractae sunt per monitorationem valoris vitae roGFP2 cum exogena 10 mM H2O2 ad ACSF perfusionis addebatur (ad oxidationem maximam faciendam, quod vitam augendam effecit), et deinde addebatur 2 mM dithiothreitoli (gradum reductionis ad minimum faciendum, quod vitam decrescere facit) (Figura S8, D ad G). Adhibebatur programmate FLIMfit 5.1.1 ad analysandum resultata acquisita, aptabatur unica curva exponentialis decrementi totius imaginis ad IRF (functionem responsus instrumenti) mensuratam, et χ2 est circiter 1. Ad vitam unius PN calculandam, larva circa corpus nervi manu delineata est, et vita media in unaquaque larva ad quantificationem adhibita est.
Analysis potentialis mitochondrialis. Postquam pars acuta cum 100 nM TMRM directe addito ACSF perfuso per 30 minuta incubata est, mutationes potentialis mitochondrialis nucleorum particulorum (PN) microscopio biphotonico mensuratae sunt. Imaginatio TMRM peracta est excitando specillum ad 920 nm et utendo HyD interno (tetramethylrhodamini isothiocyanate: 585/40 nm) ad signa colligenda; utendo eadem longitudine undae excitationis sed utendo diversa HyD interna (FITC: 525/50) ad imaginandum mtYFP. Utere extensione Image Calculator ImageJ ad potentiam mitochondrialem in gradu cellulae singularis aestimandam. Breviter, aequatio extensionis: signum = min (mtYFP, TMRM) adhibita est ad regionem mitochondrialem identificandam quae signum TMRM in Purkinje Somali ostendit in imagine confocali unius strati canalis correspondentis. Deinde area pixelorum in larva resultante quantificatur, deinde ad imaginem liminis singularis stratae canalis mtYFP correspondentem normalizatur ut fractio mitochondrialis potentiam mitochondrialem ostendens obtineatur.
Imago per programmata Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) deconvoluta est. Pro imaginibus tessellarum digitalibus captis, montage singularis tessellae fit utens algorithmo automatico suturae a programmate LAS-X proviso. Post calibrationem imaginis, ImageJ et Adobe Photoshop adhibentur ad imaginem ulterius tractandam et uniformiter splendorem et contrastum adaptandum. Adobe Illustrator ad praeparationem graphicam adhibeatur.
Analysis foci mtDNA. Numerus laesionum mtDNA in sectionibus cerebellaribus, anticorporibus contra DNA per microscopium confocale signatis, quantificatus est. Quaeque area destinata pro corpore cellulari et nucleo cuiusque cellulae creata est, et area respectiva utens extensione "Multi Measure" (programmate ImageJ) calculata est. Aream nuclearem ab area corporis cellulae subtrahe ut aream cytoplasmaticam obtineas. Denique, extensione "Analyze Particles" (programmate ImageJ) adhibita est ad puncta DNA cytoplasmatica indicantia mtDNA in imagine liminis automatice quantificanda, et eventus obtenti ad mediam PN murium CTRL normalizati sunt. Eventus exprimuntur ut numerus medius nucleosidum per cellulam.
Analysis expressionis proteinorum. Adhibe extensionem "Image Calculator" ab ImageJ fabricata ad aestimandam expressionem proteinorum in neuroblastomate (PN) in gradu cellulae singularis. Breviter, in imagine confocali unius strati canalis correspondentis, per aequationem: signum = min (mtYFP, anticorpus), regio mitochondrialis quae immunoreactivitatem ad certum anticorpus in Purkina ostendit, identificatur. Deinde area pixelorum in larva resultante quantificatur, et deinde normalizatur in imagine liminis unius strati canalis mtYFP ad fractionem mitochondrialem proteini monstrati obtinendam.
Analysis densitatis cellularum Purkinje. Instrumentum "Cell Counter" programmatis ImageJ ad densitatem Purkinje aestimandam adhibitum est, dividendo numerum cellularum Purkinje numeratarum per longitudinem anuli cerebellaris a cellulis numeratis occupati.
Praeparatio et collectio exemplorum. Cerebra ex grege testigo et muribus Mfn2cKO in 2% PFA/2.5% glutaraldehydo in 0.1 M solutione phosphatis tamponata (PB) fixa sunt, deinde sectiones coronales utens ciliatis (Leica Mikrosysteme GmbH, Vindobona, Austria) (crassitudo 50 ad 60 μm) praeparatae sunt. Deinde in solutione PB tamponata in 1% tetraoxido os et 1.5% kalium ferrocyanido ad temperaturam ambientem per 1 horam fixae sunt. Sectiones ter aqua destillata lavatae sunt, deinde cum 70% ethanolo cum 1% uranyl acetato per 20 minuta tinctae. Sectiones deinde in alcohole graduato dehydratae et in resina epoxydica Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, numerus catalogi 14040) inter laminas vitreas silicio obductas inclusae sunt, et denique ad 60°C in furno per 48 horas polymerizatae. Area corticis cerebellaris selecta est et sectiones tenuissimae 50 nm in Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vindobona, Austria) sectatae et in craticula cuprea 2×1 mm pellicula polystyreni obducta delectae sunt. Sectiones solutione 4% uranyl acetatis in H₂O per 10 minuta tinctae, H₂O pluries lavatae, deinde Reynolds plumbi citrato in H₂O per 10 minuta, et denique H₂O pluries lavatae sunt. Micrographae microscopio electronico transmissionis Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) captae sunt camera digitali TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Germania).
Muribus AAV infectis, cerebrum separatum et in sectionem sagittalem 1 mm crassitudinis dissectum est, et cerebellum microscopio fluorescenti examinatum est ad anulum AAV infectum (hoc est, mCherry exprimentem) identificandum. Solum experimenta in quibus iniectio AAV efficientiam transductionis altissimam strati cellularum Purkinje (hoc est, fere totius strati) in saltem duobus anulis cerebellaribus continuis efficit adhibita sunt. Ansa AAV transducta microdissecta est ad post-fixationem pernoctandam (4% PFA et 2.5% glutaraldehydi in 0.1 M solutione cocoate) et ulterius tractata. Ad inclusionem EPON, textus fixus cum 0.1 M solutione cocoate natrii (Applichem) lavatus est, et cum 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) in 0.1 M solutione cocoate natrii (Applichem) per 4 horas incubatus est, deinde per 2 horas lavatus. Ter cum 0.1 M solutione cocamide iteratum. Deinde, series ascendens ethanoli adhibita est ad incubandam singulam solutionem ethanoli ad 4°C per 15 minuta ad textum exhydratum. Textus translatus est in oxidum propyleni et per noctem in EPON (Sigma-Aldrich) ad 4°C incubatus est. Textus in EPON recenti ad temperaturam ambientem per 2 horas ponendus est, deinde ad 62°C per 72 horas includendus. Ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) et cultro adamantino (Diatome, Biel, Helvetia) utere ad sectiones ultratenues 70 nm secandas, et tingendo cum 1.5% uranyl acetato per 15 minuta ad 37°C, et tingendo cum solutione plumbi citratis per 4 minuta. Micrographa electronica capta sunt utens microscopio electronico transmissionis JEM-2100 Plus (JEOL) instructo Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) et programmate DigitalMicrograph (Gatan). Ad analysin, micrographa electronica cum zoom digitali 5000× vel 10,000× acquisita sunt.
Analysis morphologica mitochondriorum. In omnibus analysibus, lineamenta singularum mitochondriorum manu in imaginibus digitalibus programmate ImageJ delineata sunt. Diversi parametri morphologici analysantur. Densitas mitochondriorum exprimitur ut percentage, quod obtinetur dividendo aream mitochondrialem totalem cuiusque cellulae per aream cytoplasmatis (area cytoplasmatis = area cellulae - area nuclei cellulae) × 100. Rotunditas mitochondriorum calculatur formula [4π∙(area/perimetrum 2)]. Morphologia ista mitochondriorum analysata est et in duas categorias ("tubularem" et "vesicam") secundum formas principales divisa est.
Numerus et densitatis autophagosomatum/lysosomatum analysis. Programma ImageJ adhibe ad lineamenta cuiusque autophagosomatis/lysosomatis in imagine digitali manu delineanda. Area autophagosomatis/lysosomatis exprimitur ut percentage calculatum dividendo aream totalem structurae autophagosomatis/lysosomatis cuiusque cellulae per aream cytoplasmatis (area cytoplasmatis = area cellulae - area nuclei) × 100. Densitas autophagosomatum/lysosomatum calculatur dividendo numerum totalem per numerum structurarum autophagosomatum/lysosomatum per cellulam (secundum aream cytoplasmaticam) (area cytoplasmatica = area cellulae - area nuclearis).
Designatio ad sectiones acutas et praeparationem exemplaris. Pro experimentis quae designationem glucosi requirunt, segmenta cerebri acuta in cameram prae-incubationis transferantur, quae continet carbonem saturatum (95% O2 et 5% CO2), Ca2 + ACSF altum (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tampon, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosum, 1.0 mM CaCl2 et 2.0 mM MgCl2, ad pH 7.4 et 310 ad 320 mOsm accommodatum), in qua glucosum est 13C6- substitutio glucosi (Eurisotop, numerus catalogi CLM-1396). In experimentis quae notationem pyruvati requirunt, segmenta cerebri acuta ad maiorem Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tamponis, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosum, 1.0 mM CaCl2) transferantur et 2.0 mM MgCl2 addantur, pH 7.4 et 310 ad 320 mOsm accommodentur, et 1 mM 1-[1-13C]pyruvatum (Eurisotop, numerus catalogi CLM-1082) addantur. Sectiones per 90 minuta ad 37°C incubantur. Fine experimenti, sectiones celeriter solutione aquosa (pH 7.4) continenti 75 mM ammonii carbonatis lavantur, deinde in 40:40:20 (v:v:v) acetonitrili (ACN): methanoli:aqua homogenizatae sunt. Postquam sectiones in glacie per triginta minuta incubatae sunt, exempla ad 21 000 g per decem minuta ad 4°C centrifugata sunt, et supernatans perspicuum in concentratore SpeedVac siccatus est. Granulum metaboliti siccum inde resultans ad -80°C usque ad analysin conservatum est.
Analysis chromatographiae liquidae-spectrometriae massae aminoacidorum 13C-signatorum. Ad analysin chromatographiae liquidae-spectrometriae massae (LC-MS), pellet metaboliti in 75μl aquae qualitatis LC-MS (Honeywell) resuspensum est. Post centrifugationem ad 21,000 g per 5 minuta ad 4°C, 20 μl supernatantis clarificati ad analysin fluxus aminoacidorum adhibiti sunt, dum reliqua pars extracti statim ad analysin anionum adhibita est (vide infra). Analysis aminoacidorum peracta est utens protocollo derivationis benzoyli chloridi antea descripto (55, 56). In primo gradu, 10μl natrii carbonatis 100 mM (Sigma-Aldrich) ad 20μl extracti metaboliti additi sunt, et deinde 10μl benzoyli chloridi 2% (Sigma-Aldrich) ad ACN qualitatis LC additi sunt. Exemplar breviter vortex agitatum, deinde ad 21 000 g per 5 minuta ad 20°C centrifugatum est. Supernatans purgatum in ampullam autosampler 2 ml cum inserto vitreo conico (volumine 200 μl) transferendum est. Exempla analysata sunt utens systemate Acquity iClass ultra-high performance LC (Waters) connexo cum spectrometro massae altae resolutionis Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Ad analysin, 2 μl exempli derivati ​​in columnam silicae T3 altae firmitatis 100×1.0 mm (Waters) continentem particulas 1.8 μm iniecta sunt. Fluxus est 100 μl/min, et systema tamponis constat ex tampone A (10 mM ammonii formiatis et 0.15% acidi formici in aqua) et tampone B (ACN). Gradiens est ut sequitur: 0%B ad 0 minuta; 0%B. 0 ad 15% B ad 0 ad 0.1 minuta; 15 ad 17% B ad 0.1 ad 0.5 minuta; B ad 17 ad 55% ad 0.5 ad 14 minuta; B ad 55 ad 70% ad 14 ad 14.5 minuta; ad 14.5 ad 70 ad 100% B ad 18 minuta; 100% B ad 18 ad 19 minuta; 100 ad 0% B ad 19 ad 19.1 minuta; 0% B ad 19.1 ad 28 minuta (55, 56). Spectrometrum massae QE-HF in modo ionizationis positivae operatur cum ambitu massae m/z (rationis massae/oneris) 50 ad 750. Resolutio applicata est 60 000, et scopus ionicus moderationis amplificationis (AGC) obtentus est 3×10⁶, et tempus ionicum maximum est 100 millisecunda. Fons ionizationis electrospray calefactae (ESI) operatur cum tensione spargendi 3.5 kV, temperatura capillari 250°C, fluxu aeris involucri 60 AU (unitates arbitrariae), et fluxu aeris auxiliari 20 AU ad 250°C. Lens S ad 60 AU constituta est.
Analysis chromatographia anionica-MS acidorum organicorum 13C signatorum. Praecipitatum metaboliti reliquum (55μl) analysatum est utens systemate chromatographiae ionicae Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) coniuncto spectrometro massae QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Breviter, 5μl extracti metaboliti in columnam Dionex IonPac AS11-HC instructam HPLC (2 mm × 250 mm, magnitudo particularum 4μm, Thermo Fisher Scientific) in modo ansae partialis impulsivae cum ratione impletionis 1 iniecta sunt.) Columna custodis Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura columnae ad 30°C servatur, et autosampler ad 6°C constituitur. Adhibe cartuchos hydroxidi kalii aqua deionizata instructos ad gradientem hydroxidi kalii per generatorem eluentis generandum. Separatio metabolitorum fluxus 380μl/min, hoc gradiente applicato: 0 ad 3 minuta, 10 mM KOH; 3 ad 12 minuta, 10 ad 50 mM KOH; 12 ad 19 minuta, 50 ad 100 mM KOH; 19 ad 21 minuta, 100 mM KOH; 21 ad 21.5 minuta, 100 ad 10 mM KOH. Columna sub 10 mM KOH per 8.5 minuta iterum aequilibrata est.
Metabolitae eluatae cum flumine supplementi isopropanoli 150μl/min post columnam coniunguntur, deinde ad spectrometrum massae altae resolutionis, in modo ionizationis negativae operans, diriguntur. Spectrometrum massae (MS) ambitum massae ab m/z 50 ad 750 cum resolutione 60 000 observat. AGC (Concentrator Growth Control) ad 1×10⁶ constituitur, et tempus ionicum maximum ad 100 ms servatur. Fons ESI calefactus tensione pulveris 3.5 kV operatus est. Aliae constitutiones fontis ionum sunt hae: temperatura capillaris 275°C; fluxus gasis vaginae, 60 AU; fluxus gasis auxiliaris, 20 AU ad 300°C, et constitutio lentis S ad 60 AU.
Analysis datorum metabolitorum 13C signatorum. Ad analysin datorum proportionis isotoporum programmate TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific) adhibitum est. Identitas cuiusque compositi per compositum referentiale fidum comprobata et independenter analysata est. Ad analysin locupletationis isotoporum perficiendam, area chromatogrammatis ionum extracti (XIC) cuiusque isotopi 13C (Mn) extracta est ex [M + H] +, ubi n est numerus carbonii compositi destinati, ad analysin aminoacida adhibitum, vel [MH] + ad analysin anionum adhibitum. Accuratio massae XIC minus quam quinque partes per million est, et accuratio RT est 0.05 minuta. Analysis locupletationis perficitur calculando rationem cuiusque isotopi detecti ad summam omnium isotoporum compositi correspondentis. Hae proportiones dantur ut valores percentuales pro quolibet isotopo, et eventus exprimuntur ut locupletatio percentualis molaris (MPE), ut antea descriptum est (42).
Globulus neuronorum congelatus in methanolo glaciali 80% (v/v) homogeneizatus, vortex agitatus, et ad -20°C per 30 minuta incubatus est. Exemplum iterum vortex agita et ad +4°C per 30 minuta agita. Exemplum ad 21,000 g per 5 minuta ad 4°C centrifugatum est, deinde supernatans inde ortum collectum et concentratore SpeedVac ad 25°C siccatum est ad analysin subsequentem. Ut supra descriptum est, analysis LC-MS in aminoacidis cellularum selectarum peracta est. Adhibito TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific), analysis datorum per massam monoisotopicam cuiusque compositi peracta est. Normalizatio quantilitatis datorum metabolitorum per fasciculum programmatis preprocessCore (57) peracta est.
Praeparatio sectionis. Mus celeriter dioxido carbonii anesthetizatus et capite decapitatus est, cerebrum celeriter a cranio remotum, et cultro vibrante glacie repleto (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) adhibito in sectiones sagittales 300 ad 375 μm secatus est. Gasificatio carbonis frigida (95% O2 et 5% CO2). Ca2 + ACSF humilis (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tampon, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosum, 1.0 mM CaCl2 et 6.0 mM MgCl2. pH 7.4 et 310 ad 330 mOsm adaptatum. Segmenta cerebri capta in cameram continentem altioris Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrii phosphatis tamponis, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucosum, 4.0 mM CaCl2 et mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 et 310 ad 320 mOsm transferantur. Segmenta per 20 ad 30 minuta conservanda sunt ut ante inscriptionem restitui possint.
inscriptionem. Ad omnes inscriptiones, scaena microscopii camera inscriptionis fixa et lente obiectiva immersionis aquae 20x (Scientifica) instructa adhibita est. Cellulae Purkinje putativae per (i) magnitudinem corporis, (ii) situm anatomicum cerebelli, et (iii) expressionem geni reportatoris fluorescentis mtYFP identificatae sunt. Pipetta maculata cum resistentia apicis 5 ad 11 megaohms extrahitur per capillare vitreum borosilicatum (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germania) et pipettam horizontalem Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA. Omnes inscriptiones per amplificatorem ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Germania) peractae sunt, quod programmate Signal (versione 6.0, Cambridge Electronic, Cantabrigiae, UK) moderatum est. Experimentum frequentia sampling 12.5 kHz inscriptione facta est. Signum duobus filtris Bessel brevibus transituum, frequentiis abscissis 1.3 et 10 kHz respective, filtratur. Capacitas membranae et pipettae circuitu compensationis amplificatore utens compensatur. Omnia experimenta sub imperio camerae Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germania) peracta sunt, quae programmate Hokawo (versione 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germania) regebatur.
Configuratio et analysis cellularum integrarum consueta. Statim ante notationem, pipettam solutione interna imple, quae substantias sequentes continet: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM gluconas kalium, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM guanosini triphosphatis (GTP) (Na) et 10.0 mM creatinini phosphatis ad pH 7.25 accommodata sunt, et pressio osmotica 290 mOsm (saccharosa) erat. Statim post applicationem vis 0 pA ad membranam rumpendam, potentiale membranae quiescens mensuratum est. Resistentia input mensuratur applicando currentes hyperpolarizatas -40, -30, -20, et -10 pA. Magnitudinem responsus tensionis metire et legem Ohmi adhibere ad resistentiam input calculandam. Actio spontanea in finta tensionis electricae per quinque minuta notata est, et sPSC identificata et mensurata est in Igor Pro (versione 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) utens scripto recognitionis semi-automaticae. Curva IV et fluxus electricus status stabilis mensurantur figendo batteriam ad varia potentialia (incipiendo a -110 mV) et augendo tensionem in gradibus 5 mV. Productio AP probata est applicando fluxum depolarizantem. Fige cellulam ad -70 mV dum impulsus fluxus depolarizantis applicatur. Magnitudinem graduum cuiusque unitatis inscriptionis separatim accommoda (10 ad 60 pA). Calcula frequentiam maximam AP manualiter numerando aculeos impulsuum qui frequentiam maximam AP causant. Limen AP analysatur utens derivativo secundo impulsus depolarizationis qui primum unum vel plura AP incitat.
Configuratio et analysis maculae perforatae. Notationem maculae perforatae peragere protocollis consuetis. Pipetta sine ATP et GTP adhibenda est, quae haec ingredientia non contineat: 128 mM gluconas K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA et 2 mM MgCl2, et pH ad 7.2 (KOH utens) adaptanda. ATP et GTP ex solutione intracellulari omittuntur ne permeabilitas immoderata membranae cellularis fiat. Pipetta maculae solutione interna amphotericinum continente (circiter 200 ad 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) impletur ut notatio maculae perforatae obtineatur. Amphotericinum in dimethylsulfoxido dissolutum est (concentratio finalis: 0.1 ad 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Concentratio DMSO adhibita nullum effectum significantem in neurones studiatos habuit. Per processum perforationis, resistentia canalis (Ra) continenter observata est, et experimentum inceptum est postquam amplitudo Ra et PA stabilizata est (20-40 minuta). Actio spontanea in finibus tensionis et/vel currentis per 2 ad 5 minuta mensuratur. Analysis datorum peracta est utens Igor Pro (versione 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versione 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) et GraphPad Prism (versione 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Civitatibus Foederatis Americae). Ad PA spontanea identificanda, extensionem NeuroMatic v3.0c IgorPro adhibitam est. PA automatice identifica utens limine dato, quod singillatim pro quolibet registro adaptatur. Utente intervallo aculeorum, frequentiam aculeorum cum maxima frequentia aculeorum instantanea et frequentia aculeorum media determina.
Isolatio PN. Protocollo antea edito adaptato, PN e cerebello murino in stadio definito purificatae sunt (58). Breviter, cerebellum dissectum et in medio dissociationis glaciali [sine HBSS Ca2+ et Mg2+, supplemento glucosi 20 mM, penicillino (50 U/ml) et streptomycino (0.05 mg/ml)] minutatim concisum est, deinde medium in papaino [HBSS, supplemento 1-cysteino·HCl (1 mg/ml), papaino (16 U/ml) et deoxyribonucleasi I (DNase I; 0.1 mg/ml)] digestum est. Per 30 minuta ad 30°C tractatum. Primum textus in medio HBSS cum muco ovi (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) et DNase (0.1 mg/ml) lava ad temperaturam ambientem ne digestio enzymatica fiat, deinde in medio HBSS cum 20 mM glucosi leniter terendo, penicillinum (50 U/ml), streptomycinum (0.05 mg/ml) et DNase (0.1 mg/ml) cellulas singulas liberant. Suspensio cellularum inde orta per colum cellulare 70μm filtrata est, deinde cellulae per centrifugationem (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) pelletatae et in medio separatorio [HBSS, supplemento 20 mM glucosi, 20% serum fetale bovinum, penicillinum (50 U/ml) et streptomycinum (0.05 mg/ml)] resuspensae sunt; viabilitatem cellularum cum iodido propidii aestima et densitatem cellularem ad 1×10⁶ ad 2×10⁶ cellulae/ml adapta. Ante cytometriam fluxus, suspensio per colum cellulare 50 μm filtrata est.
Cytometrum fluxus. Separatio cellularum peracta est ad 4°C utens machina FACSAria III (BD Biosciences) et programmate FACSDiva (BD Biosciences, versione 8.0.1). Suspensio cellularum separata est utens rostro 100 μm sub pressione 20 psi cum celeritate ~2800 eventuum/sec. Cum criteria obturationis traditionalia (magnitudo cellularum, discriminatio bimodalis, et proprietates dispersionis) non possint praestare rectam isolationem PN ab aliis generibus cellularum, strategia obturationis constituitur secundum comparationem directam intensitatis YFP et autofluorescentiae in muribus mitoYFP+ ​​et mitoYFP− moderantibus. YFP excitatur irradiando exemplum linea laserica 488 nm, et signum detegitur utens filtro band-pass 530/30 nm. In muribus mitoYFP+, vis relativa geni reporter Rosa26-mitoYFP etiam adhibetur ad distinguenda fragmenta corporis neuronalis et axonum. 7-AAD lasere flavo 561 nm excitatur et filtro transverso 675/20 nm detegitur ad cellulas mortuas excludendas. Ut astrocyti simul separarentur, suspensio cellularum ACSA-2-APC tincta est, deinde exemplum linea laseris 640 nm irradiatum est, et filtro transverso 660/20 nm ad signum detegendum adhibito.
Cellulae collectae per centrifugationem (1110 rpm, 5 minuta, 4°C) in pelles divisae et ad -80°C usque ad usum conservatae sunt. Mures Mfn2cKO et catuli eorum eodem die classificantur ad variabilitatem proceduralem minuendam. Repraesentatio et analysis datorum FACS per programmata FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) peractae sunt.
Ut supra dictum est (59), PCR in tempore reali adhibita est ad DNA ex neuronis selectis separandum, ad subsequentem quantificationem mtDNA. Linearitas et sensibilitas liminis initialiter probatae sunt per qPCR in variis numeris cellularum. Breviter, 300 PN in liquore lysis consistente ex 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 et proteinasi K (200 ng/ml) colliguntur et ad 55°C per 120 minuta incubantur. Cellulae ulterius ad 95°C per 10 minuta incubantur ad completam inactivationem proteinasi K confirmandam. Adhibito specillo TaqMan (Thermo Fisher) specifico ad mt-Nd1, mtDNA mensurata est per PCR semi-quantitativam in systemate 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, numerus catalogi Mm04225274_s1), gena mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numerus catalogi AIVI3E8) et 18S (Thermo Fisher Scientific, numerus catalogi Hs99999901_s1).
Praeparatio speciminis proteomi. Solutio ad 95°C per 10 minuta calefacta et sonicata in liquore lysis [6 M guanidini chloridum, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphini hydrochloridum, 10 mM chloroacetamidum et 100 mM tris-Lysis granula neuronorum congelatorum in HCl]. In Bioruptore (Diagenode) per 10 minuta (30 secundis pulsus / 30 secundis pausa). Specimen in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) 1:10 dilutum est, cum 300 ng trypsini auri (Promega) mixtum, et per noctem ad 37°C incubatum ad digestionem completam consequendam. Die secundo, specimen ad 20,000 g per 20 minuta centrifugatum est. Supernatans cum 0.1% acido formico dilutum est, et solutio cum StageTips manu factis desalita est. Exemplum in instrumento SpeedVac (concentrator Eppendorf plus 5305) ad 45°C siccatum est, deinde peptidum in acido formico 0.1% suspensum est. Omnia exempla simul ab eadem persona praeparata sunt. Ad exempla astrocytorum analyzanda, 4 μg peptidorum desaltorum cum indice massae tandem (TMT10plex, numerus catalogi 90110, Thermo Fisher Scientific) signata sunt cum proportione peptidi ad reagentem TMT 1:20. Ad signandum TMT, 0.8 mg reagentis TMT in 70 μl ACN anhydrici resuspensum est, et peptidum siccum in 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonatis) reconstitutum est, cui 7 μl reagentis TMT in ACN additum est. Concentratio 43.75% erat. Post 60 minuta incubationis, reactio cum 2 μl hydroxylamini 5% extincta est. Peptida signata collecta, exsiccata, in 200μl acidi formici (FA) 0.1% resuspensa, in duas partes divisa, deinde per StageTips manu facta desalita sunt. Chromatographo liquido UltiMate 3000 ultra high performance (chromatographo liquido UltiMate 3000 ultra high performance) utens, altera ex duabus partibus in columna chromatographica Acquity 1mm x 150mm, particulis C18 130Å1.7μm repleta (Waters, catalogus No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Peptida separanda sunt fluxu 30μl/min, separanda ab 1% ad 50% liquore B per 85 minuta cum gradiente gradatim 96 minutorum, a 50% ad 95% liquore B per 3 minuta, deinde 8 minuta pro 95% liquore B; Buffer A est 5% ACN et 10 mM ammonii bicarbonatis (ABC), et buffer B est 80% ACN et 10 mM ABC. Fractiones singulis tribus minutis collige et in duos greges (1 + 17, 2 + 18, etc.) iunge et in centrifuga vacuo sicca.
Analysis LC-MS/MS. Ad spectrometriam massae, peptida (numero r119.aq) separata sunt in columna analytica PicoFrit 25 cm, 75 μm diametro interno (nova lente obiectiva, numero partis PF7508250) instructa medio ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat). Utere EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germania). Columna ad 50°C conservata est. Buffers A et B sunt 0.1% acidum formicum in aqua et 0.1% acido formico in 80% ACN, respective. Peptida separata sunt a 6% ad 31% buffer B per 65 minuta et a 31% ad 50% buffer B per 5 minuta cum gradiente 200 nl/min. Peptida eluta analysata sunt in spectrometro massae Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Mensura m/z praecursoris peptidi perficitur cum resolutione 120,000 in spatio 350 ad 1500 m/z. Adhibita energia collisionis normalizata 27%, praecursor fortissimus cum statu electricitatis 2 ad 6 eligitur ad scissionem per dissociationem laquei C (HCD) altae energiae. Tempus cycli ad 1 s statuitur. Valor m/z fragmenti peptidi in laqueo ionum mensus est, utens minimo scopo AGC 5×10⁴ et maximo tempore injectionis 86 ms. Post fragmentationem, praecursor in indice exclusionis dynamicae per 45 s positus est. Peptida TMT-signata separata sunt in columna Acclaim PepMap 50 cm⁻¹, 75 μm crassitudinis (Thermo Fisher Scientific, numerus catalogi 164942), et spectra migrationis analysata sunt in spectrometro massae Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) instructo apparatu ionum undarum asymmetricarum campi alti (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) operatur ad duas tensiones compensationis −50 et −70 V. MS3 selectum secundum praecursorem synchronizationis ad mensuram signi ionum relationis TMT adhibetur. Separatio peptidorum peracta est in EASY-nLC 1200, utens elutione gradiente lineari 90%, cum concentratione tamponis 6% ad 31%; tampon A erat 0.1% FA, et tampon B erat 0.1% FA et 80% ACN. Columna analytica operatur ad 50°C. Utere FreeStyle (versione 1.6, Thermo Fisher Scientific) ad dividendum fasciculum originalem secundum tensionem compensationis FAIMS.
Identificatio et quantificatio proteinorum. Adhibito instrumento integrato ad quaerendum Andromeda, data originalia analysata sunt per MaxQuant versione 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Praeter sequentias Cre recombinasis et YFP ex *Aequorea victoria* obtentas, spectra fragmentorum peptidi investigata sunt ad sequentiam canonicam et sequentiam isoformarum proteomis referentialis muris (Proteome ID UP000000589, ex UniProt mense Maio 2017 recepta). Oxidatio methionini et acetylatio N-terminalis proteini ut modificationes variabiles constitutae sunt; methylatio cysteini carbamoyl ut modificationes fixae constituta est. Parametri digestionis ad "specificitatem" et "trypsin/P" constituti sunt. Minimum numerum peptidorum et peptidorum rasorum ad identificationem proteinorum adhibitorum est 1; minimum numerum peptidorum singularium est 0. Sub condicionibus congruentiae mappae peptidi, proportio identificationis proteinorum erat 0.01. Optio "Secundum Peptidum" activa est. Optione "match between runs" utere ad identificationes prosperas inter diversos fasciculos originales transferendas. Numerum rationis minimae LFQ 1 ad quantificationem sine inscriptionibus (LFQ) (60) utere. Intensitas LFQ pro duobus saltem valoribus validis in uno saltem grege genotypi in quoque tempore filtratur, et ex distributione normali cum latitudine 0.3 et deorsum 1.8 extrapolatur. Ad analysin eventuum LFQ utere suggestu computandi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) et R (https://r-project.org/). Probatio t bidirectionalis moderata ex fasciculo programmatis limma ad analysin expressionis differentialis (61) adhibita est. Analysis exploratoria datorum per ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally et pheatmap perficitur. Data proteomica TMT-fundata per MaxQuant versione 1.6.10.43 analysata sunt. Quaerite notitias proteomicas crudas ex indice proteomicae humanae UniProt, qui mense Septembri anni 2018 receptus est. Analysis includit factorem correctionis puritatis isotoporum a fabricante provisum. Utere `limma` in R ad analysin expressionis differentialis. Notitiae originales, eventus investigationis in indice, et fluxus operis et eventus analysis notitiarum omnia in foedere ProteomeXchange per repositorium sociorum PRIDE cum identificatore collectionis notitiarum PXD019690 servantur.
Annotationes functionales analysin locupletant. Instrumentum Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) adhibitum est ad divitias terminorum annotationum functionalium copiae datorum post octo hebdomades determinandas (Figura 1). Breviter, index quantitativus proteinorum ex analysi datorum LC-MS/MS (tandem mass spectrometria) obtentus cum sequentibus criteriis filtrationis adhibetur: Mus musculus ut species et fons electus est, et categoria ostendit valorem P a Benjamini pro ditamento 0.05 vel minore correctum, qui significans habetur. Pro hoc graphio, quinque categoriae excessus summae in quoque grege, secundum valorem P correctum, monstrantur. Utentes probatione t multiplici, programmate amplificationis linearis duorum graduum Benjamini, Krieger, et Yekutieli (Q = 5%), analysis expressionis proteinorum per tempus in candidatis magnis in quoque categoria identificatis perficitur, et quaeque linea separatim analysatur. Non opus est SD constantem adoptare.
Ut huius studii eventus cum datis databilibus editis comparemus et diagramma Venn in Figura 1 generaremus, indicem quantitativum proteinorum cum annotationibus MitoCarta 2.0 (24) coniunximus. Instrumento interretiali "Draw Venn Diagram" (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ad diagramma generandum utimur.
De rationibus statisticis ad analysin proteomicam adhibitis, si vis, vide sectionem correspondentem "Materiarum et Methodorum". De ceteris experimentis, informationes singulares in indice correspondenti inveniri possunt. Nisi aliter specificatum est, omnia data exprimuntur ut media ± SEM, et omnes analyses statisticae per programmata GraphPad Prism 8.1.2 peractae sunt.
Pro materiis supplementis ad hunc articulum, vide quaeso http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1.
Hic est articulus apertus et sub condicionibus Licentiae Creative Commons Attribution-Non-Commercial distributus, quae usum, distributionem et reproductionem in quolibet medio permittit, dummodo usus finalis non sit ad lucrum commercialem et praemissa sit opus originale rectum esse. Referentia.
Nota: Solum rogamus ut inscriptionem electronicam tuam praebeas, ut persona quam paginae commendas sciat te velle eam videre epistulam et eam non esse spam. Nullas inscriptiones electronicas capemus.
Haec quaestio adhibetur ad explorandum utrum sis visitator et ad prohibendam submissionem automaticam epistularum inutilium.
By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analysis proteomica neuronorum dysfunctionalium revelavit programmata metabolica activari ad neurodegenerationem resistendum.
By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analysis proteomica neuronorum dysfunctionalium revelavit programmata metabolica activari ad neurodegenerationem resistendum.
©2020 Societas Americana ad profectum Scientiae. omnia iura reservata. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et CONTRA. ISSN 2375-2548.