Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatoris tui quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optimis eventibus, commendamus ut recentiorem versionem navigatoris tui utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer debilites). Interea, ut sustentationem continuam praebeamus, situm sine stylis vel JavaScript monstramus.
Acidum propionicum (PPA) adhibetur ad munus dysfunctionis mitochondrialis in perturbationibus neurodevelopmentalibus, ut perturbatione spectri autismi, investigandum. PPA notum est biogenesin, metabolismum, et renovationem mitochondrialem perturbare. Attamen effectus PPA in dynamicam, fissionem et fusionem mitochondrialem problematici manent propter naturam temporalem complexam horum mechanismorum. Hic, utimur technicis quantitativis complementariis ad investigandum quomodo PPA ultrastructuram, morphologiam, et dynamicam mitochondrialem in cellulis SH-SY5Y neuronibus similibus afficit. PPA (5 mM) decrementum significans in area mitochondriali (p < 0.01), diametro et circumferentia Feret (p < 0.05), et area 2 (p < 0.01) effecit. Analysis locatoris eventuum mitochondrialium augmentum significans (p < 0.05) in eventibus fissionis et fusionis ostendit, ita integritatem retiaculi mitochondrialis sub condicionibus stressis servans. Praeterea, expressio mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) et OPA1 (p < 0.05) significanter redacta est. (01). Hoc illustrat reformationem morphologiae, biogenesis et dynamicae mitochondrialis ad functionem sub condicionibus stress conservandam. Nostra data novam perspicaciam in effectus PPA in dynamica mitochondriali praebent et utilitatem technicarum imaginandi ad investigandos mechanismos regulatorios complexos implicatos in responsionibus stress mitochondrialibus illustrant.
Mitochondria participes integrales sunt in variis functionibus cellularibus, ultra partes suas typicas in productione energiae et biosynthesi. Metabolismus mitochondrialis est regulator clavis signalationis calcii, homeostasis metabolicae et redox, signalationis inflammatoriae, modificationum epigeneticarum, proliferationis cellularis, differentiationis et mortis cellularis programmatae. Imprimis, metabolismus mitochondrialis criticus est ad evolutionem, superviventiam et functionem neuronalis et late implicatus est in variis manifestationibus neuropathologiae.
Per decennium proximum, status metabolicus quasi regulator centralis neurogenesis, differentiationis, maturationis et plasticitatis emersit5,6. Nuper, morphologia et dynamica mitochondrialis partes mitosis imprimis importantes factae sunt, processus dynamici qui copiam mitochondriorum sanorum intra cellulas conservat. Dynamica mitochondrialis regulatur viis complexis et interdependentibus, a biogenesi et bioenergetica mitochondriali ad fissionem, fusionem, translationem et purgationem mitochondrialem7,8. Perturbatio cuiuslibet horum mechanismorum integrativorum conservationem retium mitochondrialium sanorum impedit et profundas consequentias functionales pro neuroevolutione habet9,10. Re vera, dysregulatio dynamicae mitochondrialis observatur in multis perturbationibus psychiatricis, neurodegenerativis et neuroevolutionis, inter quas perturbationes spectri autismi (ASD)11,12.
Morbus spectri autistici (ASD) est morbus neurodevelopmentalis heterogeneus cum architectura genetica et epigenetica complexa. Hereditatio ASD non controversa est, sed aetiologia molecularis subiacens adhuc parum intellecta manet. Data accumulata ex exemplaribus prae-clinicis, studiis clinicis, et collectionibus datorum molecularium multi-omicis crescentes probationes dysfunctionis mitochondrialis in ASD praebent13,14. Antehac perscrutationem methylationis DNA per totum genoma in cohorte aegrotorum cum ASD perfecimus et genes differentialiter methylatas secundum vias metabolicas mitochondriales congregatas identificavimus15. Deinde methylationem differentialem regulatorum centralium biogenesis et dynamicae mitochondrialis rettulimus, quae cum numero exemplarium mtDNA aucto et mutato profilo metabolico urinario in ASD associata erat16. Nostra data crescentes probationes praebent dynamicam mitochondrialem et homeostasis partes centrales in pathophysiologia ASD agere. Ergo, melioratio intellectus mechanistici relationis inter dynamicam, morphologiam, et functionem mitochondrialem est finis clavis investigationis continuae in morbos neurologicos a dysfunctione mitochondriali secundaria insignitos.
Technicae moleculares saepe adhibentur ad munus genorum specificorum in responsionibus ad accentum mitochondrialem investigandum. Attamen, haec methodus fortasse limitatur natura multiforme et temporali mechanismorum moderationis mitoticae. Praeterea, expressio differentialis genorum mitochondrialium est indicator indirectus mutationum functionalium, praesertim cum numerus limitatus genorum typice analysatur. Quapropter, methodi directiores ad functionem mitochondrialem et bioenergeticam studendam propositae sunt17. Morphologia mitochondrialis arcte cum dynamica mitochondriali coniuncta est. Forma, connectivitas et structura mitochondrialis necessariae sunt ad productionem energiae et superviventiam mitochondrialem et cellularum5,18. Insuper, variae partes mitosis in mutationibus in morphologia mitochondriali intendunt, quae ut fines utiles dysfunctionis mitochondrialis servire et basin praebere possunt studiis mechanicis subsequentibus.
Morphologia mitochondrialis directe observari potest per microscopiam electronicam transmissionis (TEM), quae studium accuratum ultrastructurae cellularis permittit. TEM morphologiam, formam et structuram cristarum mitochondrialium directe visualizat ad resolutionem singularum mitochondriorum, potius quam solum transcriptioni genorum, expressioni proteinorum vel parametris functionalibus mitochondrialibus in populationibus cellularum confidere17,19,20. Praeterea, TEM studium interactionum inter mitochondria et alia organella, ut reticulum endoplasmicum et autophagosomata, quae partes clavis in functione et homeostasis mitochondriali agunt, facilitat21,22. Itaque, hoc TEM bonum initium facit ad dysfunctionem mitochondrialem studendam antequam in vias vel genes specificas intendatur. Cum functio mitochondrialis magis magisque ad neuropathologiam pertinens fiat, manifesta necessitas est posse directe et quantitative morphologiam et dynamicam mitochondrialem in exemplaribus neuronalibus in vitro studere.
In hoc articulo, dynamicam mitochondrialem in exemplo neuronali dysfunctionis mitochondrialis in perturbatione spectri autismi examinamus. Antehac methylationem differentialem propionyl-CoA carboxylasis beta (PCCB) in ASD15, subunitate enzymi propionyl-CoA carboxylasis mitochondrialis PCC, rettulimus. Dysregulatio PCC accumulationem toxicam derivatorum propionylicorum, incluso acido propionico (PPA), causare notum est [23,24,25]. PPA metabolismum neuronalem perturbare et mores in vivo mutare demonstratum est et exemplar animale stabilitum est ad mechanismos neurodevelopmentalitatis in ASD implicatos investigandos [26,27,28]. Praeterea, PPA potentialem membranae mitochondrialis, biogenesin et respirationem in vitro perturbare relatum est et late adhibitum est ad dysfunctionem mitochondrialem in neuronibus imitandam [29,30]. Attamen, impetus dysfunctionis mitochondrialis a PPA inductae in morphologiam et dynamicam mitochondrialem parum intellectum manet.
Hoc studium utitur technicis imaginum complementariis ad quantificandos effectus PPA in morphologiam, dynamicam, et functionem mitochondrialem in cellulis SH-SY5Y. Primo, methodum TEM elaboravimus ad visualizandas mutationes in morphologia et ultrastructura mitochondriali17,31,32. Data natura dynamica mitochondriorum33, etiam analysin localizatoris eventuum mitochondrialium (MEL) adhibuimus ad quantificandas mutationes in aequilibrio inter eventa fissionis et fusionis, numerum et volumen mitochondrialem sub pressione PPA. Denique examinavimus utrum morphologia et dynamica mitochondrialia cum mutationibus in expressione genorum implicatorum in biogenesi, fissione, et fusione coniungantur. Simul sumpta, nostra data illustrant provocationem elucidandae complexitatis mechanismorum dynamicam mitochondrialem regulantium. Utilitatem TEM in studio morphologiae mitochondrialis tamquam finis convergens mensurabilis mitosis in cellulis SH-SY5Y illustramus. Praeterea, illustramus data TEM informationes ditissimas praebere cum technicis imaginum quae etiam eventa dynamica in responsione ad pressionem metabolicam capiunt coniunguntur. Ulterior descriptio mechanismorum regulationis molecularis qui mitosin cellularum neuronalium sustinent, perspicientiam magni momenti in componentem mitochondrialem systematis nervosi et morborum neurodegenerativorum praebere potest.
Ad accentum mitochondrialem inducendum, cellulae SH-SY5Y cum PPA tractatae sunt, utens 3 mM et 5 mM natrii propionatis (NaP). Ante TEM, exempla praeparationi cryogenicae subiecta sunt, utens congelatione alta pressione et congelatione (Fig. 1a). Canalem automaticum ad imaginum analysin mitochondrialem elaboravimus ad octo parametros morphologicos populationum mitochondrialium per tres replicationes biologicas metiendos. Invenimus curationem PPA quattuor parametros significanter mutasse: aream 2, aream, perimetrum, et diametrum Feret (Fig. 1b-e). Area 2 significanter decrevit cum curatione PPA 3 mM et 5 mM (p = 0.0183 et p = 0.002, respective) (Fig. 1b), dum area (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) et diameter Feret omnes significanter decreverunt. Reductio significativa (p = 0.0172) fuit in grege curationis 5 mM comparato cum grege testigo (Fig. 1c-e). Magnae areae et circumferentiae reductiones demonstraverunt cellulas 5 mM PPA tractatas mitochondria minora et rotundiora habere, et has mitochondrias minus elongatas esse quam eas in cellulis comparationis. Hoc etiam congruit cum magna diminutione diametri Feret, parametro independenti indicante diminutionem maximae distantiae inter margines particularum. Mutationes in ultrastructura cristarum observatae sunt: ​​cristae minus pronuntiatae factae sunt sub influxu tensionis PPA (Fig. 1a, tabula B). Attamen, non omnes imagines ultrastructuram cristarum clare reflectebant, ita analysis quantitativa harum mutationum non peracta est. Haec data TEM tria possibilia scenaria reflectere possunt: ​​(1) PPA fissionem auget vel fusionem inhibet, mitochondria existentia magnitudine contrahi faciens; (2) biogenesis aucta nova mitochondria minora creat vel (3) ambos mechanismos simul inducit. Quamquam hae condiciones TEM distingui non possunt, mutationes morphologicae magnae mutationes in homeostasis et dynamica mitochondriali sub tensione PPA indicant. Deinde parametros additionales exploravimus ut has dynamicas et mechanismos potentiales eis subiacentes ulterius describeremus.
Acidum propionicum (PPA) morphologiam mitochondrialem reformat. (a) Imagines microscopiae electronicae transmissionis (TEM) repraesentativae ostendunt magnitudinem mitochondrialem decrescere et mitochondria minora et rotundiora fieri cum crescente curatione PPA; 0 mM (non tractata), 3 mM et 5 mM, respective. Sagittae rubrae mitochondria indicant. (b–e) Cellulae SH-SY5Y cum PPA per 24 horas tractatae ad TEM praeparatae sunt et eventus per Fiji/ImageJ analysati sunt. Quattuor ex octo parametris differentias significantes inter cellulas moderatrices (non tractatas, 0 mM PPA) et tractatas (3 mM et 5 mM PPA) ostenderunt. (b) Regio 2, (c) Area, (d) Perimetrum, (e) Diameter Feret. Analysis variantiae unidirectionalis (control vs. tractatio) et probatio comparationis multiplicis Dunnett adhibitae sunt ad differentias significantes determinandas (p < 0.05). Puncta datorum valorem mitochondrialem medium pro singulis cellulis repraesentant, et virgae erroris medium ± SEM repraesentant. Data ostensa n = 3 repraesentant, saltem 24 cellulas per replicatum; summa 266 imaginum analysatae sunt; * indicat p < 0.05, ** indicat p < 0.01.
Ut ulterius describeremus quomodo dynamica mitochondrialis PPA respondeat, mitochondria tetramethylrhodamini aethyl estere (TMRE) tinximus et microscopia temporis intervalli necnon analysi MEL adhibuimus ad mitochondria localizanda et quantificanda post 24 horas ad 3 et 5 mM PPA. Tractatio eventuum fissionis et fusionis. (Fig. 2a). Post analysin MEL, mitochondria ulterius analysata sunt ad numerum structurarum mitochondrialium et volumen medium earum quantificandum. Incrementum parvum sed significans in numero eventuum fissionis observavimus, qui ad 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] comparati cum fissione [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] et fusione [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] et fusione [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] (0.05)] <0.05)] significanter aucti sunt ad 5 mM comparati cum testibus (Fig. 3b). Numerus mitochondriorum significanter auctus est ad 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] et 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), dum volumen medium cuiusque structurae mitochondrialis immutatum mansit (Fig. 3c). 3d). Haec omnia simul sumpta suggerunt reformationem dynamicae mitochondrialis quasi responsum compensatorium esse quod integritatem retiaculi mitochondrialis feliciter conservat. Incrementum numeri eventuum fissionis ad 3 mM PPA suggerit incrementum numeri mitochondrialis partim fissioni mitochondriali deberi, sed cum volumen mitochondriale medium essentialiter immutatum maneat, biogenesis ut responsum compensatorium additionale excludi non potest. Attamen haec data congruunt cum structuris mitochondrialibus minoribus, rotundis, per TEM observatis, et etiam mutationes significantes in dynamica mitochondriali a PPA inducta demonstrant.
Acidum propionicum (PPA) reformationem mitochondrialem dynamicam inducit ad integritatem retium conservandam. Cellulae SH-SY5Y cultae, cum PPA 3 et 5 mM per 24 horas tractatae, et cum TMRE et Hoechst 33342 tinctae, deinde analysi MEL factae sunt. (a) Imagines microscopiae temporis-lapsus repraesentativae, colores et projectiones maximae intensitatis binarizatas tempore 2 (t2) pro unaquaque conditione depingentes. Regiones selectae in unaquaque imagine binaria indicatae amplificantur et in 3D tribus diversis temporibus (t1-t3) exhibentur ad dynamicam per tempus illustrandam; eventa fusionis viridi colore illustrantur; eventa fissionis viridi colore illustrantur. Rubro colore exhibentur. (b) Numerus medius eventuum dynamicorum per condicionem. (c) Numerus medius structurarum mitochondrialium per cellulam. (d) Volumen medium (µm3) cuiusque structurae mitochondrialis per cellulam. Data exhibita repraesentant n = 15 cellulas per gregem curationis. Virgae errorum exhibitae mediam ± SEM repraesentant, virga scalae = 10 μm, * p < 0.05.
Acidum propionicum (PPA) suppressionem transcriptionalem genorum cum dynamicis mitochondrialibus consociatorum efficit. Cellulae SH-SY5Y cum 3 et 5 mM PPA per 24 horas tractatae sunt. Quantificatio relativa genorum per RT-qPCR peracta est et ad B2M normalizata. Gena biogenesis mitochondrialis (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 et (d) NFE2L2. Gena fusionis et fissionis mitochondrialis (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 et (i) DRP1. Differentiae significantes (p < 0.05) per ANOVA unidirectionalem (control vs. tractationem) et probationem comparationis multiplex Dunnett probatae sunt: ​​* indicat p < 0.05, ** indicat p < 0.01, et **** indicat p < 0.0001. Vectes expressionem mediam ± SEM repraesentant. Data ostensa n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), et n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replicationes biologicas repraesentant.
Data ex analysibus TEM et MEL coniuncta indicant PPA morphologiam et dynamicam mitochondrialem mutare. Attamen hae technicae imaginandi perspicuitatem in mechanismos subiacentes hos processus impellentes non praebent. Ideo expressionem mRNA novem moderatorum clavium dynamicae mitochondrialis, biogenesis, et mitosis in responsione ad curationem PPA examinavimus. Oncogen myelomae cellularis (cMYC), factorem respiratorium nuclearem (NRF1), factorem transcriptionis mitochondrialem 1 (TFAM), factorem transcriptionis similem NFE2 BZIP (NFE2L2), proteinum similem gastrini 2 (STOML2), atrophiam nervi optici 1 (OPA1), Mitofusinum 1 (MFN1), Mitofusinum 2 (MFN2), et proteinum dynamino-relatum 1 (DRP1) post 24 horas curationis cum 3 mM et 5 mM PPA quantificavimus. Curationem PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 et p < 0.0001, respective) et 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) observavimus. (Fig. 3a-c). Diminutio expressionis mRNA a dosi pendebat: expressio cMYC, NRF1 et TFAM 5.7, 2.6 et 1.9 vicibus ad 3 mM respective, et 11.2, 3 et 2.2 vicibus ad 5 mM decrevit. Contra, gen biogenesis redox centralis NFE2L2 non mutatum est ad ullam concentrationem PPA, quamquam similis inclinatio expressionis decrescentis, a dosi pendens, observata est (Fig. 3d).
Expressionem genorum classicorum, quae in regulatione fissionis et fusionis implicantur, etiam examinavimus. STOML2 putatur implicari in fusione, mitophagia et biogenesi, et expressio eius significanter redacta est (p < 0.0001) per 3 mM (mutatio 2.4-plicis) et 5 mM (mutatio 2.8-plicis) PPA (Fig. 1). 3d). Similiter, expressio geni fusionis OPA1 imminuta est ad 3 mM (mutatio 1.6-plicis) et 5 mM (mutatio 1.9-plicis) PPA (p = 0.006 et p = 0.0024, respective) (Fig. 3f). Nihilominus, differentias significantes in expressione genorum fusionis MFN1, MFN2 vel geni fissionis DRP1 sub 24-horarum pressione PPA non invenimus (Fig. 3g-i). Praeterea, invenimus gradus quattuor proteinorum fusionis et fissionis (OPA1, MFN1, MFN2 et DRP1) sub eisdem condicionibus non mutatos esse (Fig. 4a-d). Interest notare haec data unum punctum temporis reflectere et fortasse mutationes in expressione proteinorum vel gradibus activitatis per prima stadia accentus PPA non reflectere. Tamen, significantes reductiones in expressione cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 et OPA1 significantem dysregulationem transcriptionalem metabolismi, biogenesis et dynamicae mitochondrialis indicant. Accedit quod haec data utilitatem technicarum imaginandi ad mutationes status finalis in functione mitochondriali directe studendas illustrant.
Gradus proteinorum fusionis et fissionis factoris post curationem acidi propionici (PPA) non mutati sunt. Cellulae SH-SY5Y cum 3 et 5 mM PPA per 24 horas tractatae sunt. Gradus proteinorum per analysin Western blot quantificati sunt, et gradus expressionis ad proteinum totale normalizati sunt. Expressio proteinorum media et Western blots repraesentativae proteini scopi et totalis monstrantur. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Vectes mediam ± SEM repraesentant, et data monstrata repraesentativa sunt n = 3 replicationum biologicarum. Comparationes multiplices (p < 0.05) per analysin variantiae unidirectionalem et probationem Dunnett factae sunt. Gel et blot originales in Figura S1 monstrantur.
Dysfunctio mitochondrialis cum morbis multisystemicis coniungitur, a morbis metabolicis, cardiovascularibus et muscularibus ad morbos neurologicos1,10. Multi morbi neurodegenerativi et neurodegenerativi cum dysfunctione mitochondriali coniunguntur, quod momentum horum organellorum per totam vitam cerebri illustrat. Hi morbi includunt morbum Parkinsonianum, morbum Alzheimerianum et ASD3,4,18. Attamen, accessus ad textus cerebri ad hos morbos studendos difficilis est, praesertim in gradu mechanistico, quod systemata exemplorum cellularium alternativam necessariam facit. In hoc studio, systema exemplorum cellularium utimur utens cellulis SH-SY5Y PPA-tractatis ad recapitulandam dysfunctionem mitochondrialem observatam in morbis neuronalibus, praesertim perturbationibus spectri autismi. Usus huius exempli PPA ad studendum dynamicam mitochondrialem in neuronibus perspicuitatem in aetiologiam ASD praebere potest.
Possibilitatem utendi TEM ad mutationes in morphologia mitochondriali inspiciendas exploravimus. Interest notare TEM recte adhibendum esse ad eius efficaciam maximam. Praeparatio cryospeciminum meliorem conservationem structurarum neuronalium permittit, simul componentes cellulares figendo et formationem artefactorum reducendo34. His congruenter, observavimus cellulas SH-SY5Y neuronibus similes organella subcellularia integra et mitochondria elongata habere (Fig. 1a). Hoc utilitatem technicarum praeparationis cryogenicae ad morphologiam mitochondrialem in exemplaribus cellularum neuronalium studendam illustrat. Quamquam mensurae quantitativae ad analysin obiectivam datorum TEM necessariae sunt, nondum consensus est de quibus parametris specificis metiri debeant ad mutationes morphologicas mitochondriales confirmandas. Innixi magno numero studiorum quae morphologiam mitochondrialem quantitative examinaverunt17,31,32, canalem automaticum analysis imaginum mitochondrialium elaboravimus, qui octo parametros morphologicos metitur, scilicet: aream, aream2, proportionem aspectus, perimetrum, circularitatem, gradum, diametrum Feret et rotunditatem.
Inter ea, PPA aream 2, aream, perimetrum, et diametrum Feret significanter minuit (Fig. 1b-e). Hoc demonstravit mitochondria minora et rotundiora facta esse, quod congruit cum studiis prioribus quae decrementum areae mitochondrialis post 72 horas tensionis mitochondrialis a PPA30 inductae demonstraverunt. Hae notae morphologicae fissionem mitochondrialem indicare possunt, processum necessarium ad componentes laesos a rete mitochondriale sequestrandos ut degradationem earum per mitophagiam promoveant35,36,37. Ex altera parte, decrementum magnitudinis mitochondrialis mediae cum biogenesi aucta coniungi potest, quae formationem mitochondriorum parvorum nascentium efficit. Fissio vel biogenesis aucta responsum compensatorium ad mitosin contra tensionem mitochondrialem conservandam repraesentat. Attamen, incrementum mitochondriale imminutum, fusio impedita, vel aliae condiciones excludi non possunt.
Quamquam imagines altae resolutionis per TEM creatae permittunt determinationem notarum morphologicarum in gradu singularum mitochondriorum, haec methodus imagines bidimensionales uno tempore producit. Ad responsa dynamica ad accentum metabolicum investiganda, mitochondria TMRE tinximus et microscopiam temporis intervalli cum analysi MEL adhibuimus, quae visualisationem tridimensionalem magnae capacitatis mutationum in reti mitochondriali per tempus permittit33,38. Mutationes subtiles sed significantes in dynamica mitochondriali sub accentu PPA observavimus (Fig. 2). Ad 3 mM, numerus eventuum fissionis significanter auctus est, dum eventus fusionis idem manebant ac in exemplo comparationis. Incrementum numeri eventuum tam fissionis quam fusionis observatum est ad 5 mM PPA, sed hae mutationes fere proportionales erant, suggerentes cineticam fissionis et fusionis aequilibrium ad altiores concentrationes attingere (Fig. 2b). Volumen mitochondriale medium immutatum mansit ad 3 et 5 mM PPA, indicando integritatem reti mitochondrialis servatam esse (Fig. 2d). Hoc facultatem retium mitochondrialium dynamicarum ad respondendum levi tensioni metabolicae ad homeostasis efficaciter conservandam sine fragmentatione retium reflectit. Ad 3 mM PPA, incrementum fissionis sufficit ad transitionem ad novum aequilibrium promovendam, sed profundior reformatio cinetica requiritur in responsione ad tensionem inductam a maioribus concentrationibus PPA.
Numerus mitochondriorum ad ambas concentrationes tensionis PPA auctus est, sed volumen mitochondriale medium significanter non mutatum est (Fig. 2c). Hoc fortasse ob biogenesin auctam vel divisionem auctam fieri potest; tamen, absente significanti diminutione voluminis mitochondrialis medii, verisimilius est biosynthesis augeri. Nihilominus, data in Figura 2 existentiam duorum mechanismorum compensatoriorum confirmant: augmentum numeri eventuum fissionis, congruens cum augmentatione fissionis mitochondrialis, et augmentum numeri eventuum, congruens cum biogenesi mitochondriali. Denique, compensatio dynamica pro tensione levi ex processibus simultaneis fissionem, fusionem, biogenesin et mitophagiam implicantibus constare potest. Quamquam auctores priores demonstraverunt PPA mitosin30,39 et mitophagiam29 augere, nos argumenta pro reformatione dynamicae fissionis et fusionis mitochondrialis in responsione ad PPA praebemus. Haec data mutationes morphologicas per TEM observatas confirmant et ulteriorem perspicientiam in mechanismos cum dysfunctione mitochondriali a PPA inducta coniunctos praebent.
Quia neque analysis TEM neque MEL argumenta directa praebuerunt de mechanismis regulatoriis genorum subiacentibus mutationibus morphologicis observatis, expressionem RNA genorum in metabolismo, biogenesi, et dynamica mitochondriali implicatorum examinavimus. Proto-oncogen cMYC est factor transcriptionis implicatus in regulatione mitochondriorum, glycolysis, metabolismi aminoacidorum et acidorum pinguium40. Praeterea, cMYC notum est expressionem fere 600 genorum mitochondrialium implicatorum in transcriptione, translatione, et aggregatione complexorum mitochondriali, inter quos NRF1 et TFAM41, moderari. NRF1 et TFAM sunt duo regulatores centrales mitosis, agentes deorsum a PGC-1α ad replicationem mtDNA activandam. Haec via activatur per signalationes cAMP et AMPK et sensibilis est ad expensum energiae et accentum metabolicum. Etiam NFE2L2, regulatorem redox biogenesis mitochondrialis, examinavimus ad determinandum utrum effectus PPA a accentu oxidativo mediari possint.
Quamquam expressio NFE2L2 immutata mansit, constantem decrementum dosi-dependens in expressione cMYC, NRF1 et TFAM post 24 horas curationis cum 3 mM et 5 mM PPA invenimus (Fig. 3a-c). Deminutio expressionis cMYC antea relata est ut responsio ad accentum mitochondrialem42, et contra, deminutio expressionis cMYC dysfunctionem mitochondrialem causare potest per remodellationem metabolismi mitochondrialis, connectivitatis retium, et polarizationis membranae43. Interest notare quod cMYC etiam implicatur in regulatione fissionis et fusionis mitochondrialis42,43 et notum est augere phosphorylationem DRP1 et localizationem mitochondrialem per divisionem cellularem44, necnon mediare remodellationem morphologicam mitochondrialem in cellulis neuronalibus primordialibus45. Revera, fibroblastae cMYC-deficientes magnitudinem mitochondrialem reductam exhibent, quod congruit cum mutationibus a accentu PPA43 inductis. Haec data illustrant relationem interessantem sed adhuc obscuram inter cMYC et dynamicam mitochondrialem, praebentes scopum interessantem studiis futuris remodellationis a accentu PPA inductae.
Reductio NRF1 et TFAM congruit cum munere cMYC tamquam activatoris transcriptionalis magni momenti. Haec data etiam congruunt cum studiis prioribus in cellulis cancri coli humani, quae demonstraverunt PPA expressionem mRNA NRF1 post horas 22 minuisse, quod cum depletione ATP et ROS46 auctum coniunctum erat. Hi auctores etiam rettulerunt expressionem TFAM post horas 8.5 auctam esse, sed ad gradus basales post horas 22 rediisse. Contra, Kim et al. (2019) demonstraverunt expressionem mRNA TFAM significanter diminutam esse post 4 horas accentus PPA in cellulis SH-SY5Y; tamen, post horas 72, expressio proteini TFAM significanter aucta est et numerus exemplarium mtDNA significanter auctus est. Ergo, diminutio numeri genorum biogenesis mitochondrialis, quam post horas 24 observavimus, non excludit possibilitatem augmentum numeri mitochondriorum cum activatione biogenesis temporibus prioribus coniunctum esse. Studia priora demonstraverunt PPA mRNA et proteinum PGC-1α in cellulis SH-SY5Y post horas 4 et minuta 30 significanter augere, dum acidum propionicum biogenesin mitochondrialem in hepatocytis vituli per PGC-1α post horas 12 et minuta 39 auget. Interest notare quod PGC-1α non solum regulator transcriptionalis directus NRF1 et TFAM est, sed etiam demonstratum est actionem MFN2 et DRP1 moderari per fissionem et fusionem moderandam47. Haec omnia simul sumpta artam nexum mechanismorum moderantium responsa compensatoria mitochondrialia a PPA inducta illustrant. Praeterea, nostra data significantem dysregulationem moderationis transcriptionalis biogenesis et metabolismi sub pressione PPA reflectunt.
Gena STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 et DRP1 inter regulatores centrales fissionis, fusionis et dynamicae mitochondrialis sunt37,48,49. Multa alia gena in dynamica mitochondriali implicata sunt, tamen STOML2, OPA1 et MFN2 antea differentialiter methylata in cohortibus ASD inventa sunt,16 et plura studia independentia mutationes in his factoribus transcriptionis in responsione ad accentum mitochondrialem rettulerunt50,51.52. Expressio et OPA1 et STOML2 significanter redacta est per curationem PPA 3 mM et 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 unus e regulatoribus classicis fusionis mitochondrialis est per interactionem directam cum MFN1 et 2 et munus agit in reformatione cristarum et morphologia mitochondriali53. Munus accuratum STOML2 in dynamica mitochondriali incertum manet, sed indicia suggerunt id munus agere in fusione mitochondriali, biogenesi et mitophagia.
STOML2 implicatur in conservanda copulatione respiratoria mitochondriali et formatione complexuum catenae respiratoriae54,55 et demonstratum est profunde mutare proprietates metabolicas cellularum cancrariarum56. Studia demonstraverunt STOML2 potentiam membranae mitochondrialis et biogenesin promovere per interactionem cum BAN et cardiolipino55,57,58. Praeterea, studia independentia demonstraverunt interactionem inter STOML2 et PINK1 mitophagiam moderari59,60. Notandum est STOML2 directe interagere et stabilizare MFN2 relatum esse et etiam munus grave agit in stabiliendis isoformis OPA1 longis per inhibitionem proteasis quae degradationem OPA1 efficit53,61,62. Reductio expressionis STOML2 observata in reactionibus PPA has proteinas fusionis degradationi per vias ubiquitini et proteasoma-dependentes susceptibiliores reddere potest48. Quamquam munus accuratum STOML2 et OPA1 in responsione dynamica ad PPA incertum est, expressio imminuta horum genorum fusionis (Figura 3) aequilibrium inter fissionem et fusionem perturbare et ad magnitudinem mitochondrialem imminutam ducere potest (Figura 3). 1).
Ex altera parte, expressio proteini OPA1 post 24 horas immutata mansit, dum mRNA et proteini gradus MFN1, MFN2 vel DRP1 post curationem PPA significanter non mutati sunt (Fig. 3g-i, Fig. 4). Hoc indicare potest nullas mutationes in regulatione horum factorum in fusione et fissione mitochondriali implicatorum esse. Attamen, notandum est unumquemque horum quattuor genorum etiam modificationibus post-transcriptionalibus (PTMs) regulari quae activitatem proteinorum regunt. OPA1 octo variantes splicing alternativas habet quae proteolytice in mitochondriis finduntur ad duas isoformas distinctas producendas 63. Aequilibrium inter isoformas longas et breves tandem munus OPA1 in fusione mitochondriali et conservatione reti mitochondrialis determinat 64. Activitas DRP1 regulatur phosphorylatione proteini kinasis II calcii/calmodulini dependentis (CaMKII), dum degradatio DRP1 regulatur ubiquitinatione et SUMOylatione 65. Denique, et DRP1 et MFN1/2 sunt GTPasae, ita activitas a celeritate productionis GTP in mitochondriis affici potest [66]. Ergo, quamvis expressio harum proteinarum constans maneat, hoc fortasse non immutatam activitatem vel localizationem proteinorum reflectat [67,68]. Revera, repertoria proteinorum PTM exstantia saepe primam defensionis lineam funguntur, quae mediationem responsorum ad accentus acutos efficit. In praesentia accentus metabolici moderati in nostro exemplo, probabile est PTM auctam activitatem proteinorum fusionis et fissionis promovere ad integritatem mitochondrialem sufficienter restituendam sine necessitate additionalis activationis horum genorum in gradu mRNA vel proteini.
Haec data, simul sumpta, complexam et tempore dependentem morphologiae mitochondrialis ordinationem et difficultates elucidandi hos mechanismos illustrant. Ad expressionem genorum studendam, primum necesse est gena specifica in via identificare. Attamen, nostra data ostendunt gena in eadem via non eodem modo respondere eidem tensioni. Re vera, studia priora demonstraverunt diversa gena in eadem via diversas formas responsorum temporalium exhibere posse30,46. Praeterea, sunt complexi mechanismi post-transcriptionales qui relationem inter transcriptionem et functionem genorum perturbant. Studia proteomica perspicuitatem in impulsum PTM et functionis proteinorum praebere possunt, sed etiam difficultates ponunt, inter quas methodi parvae capacitatis, altae rationes signalis ad strepitum, et resolutio mala.
In hoc contextu, studium morphologiae mitochondrialis per TEM et MEL magnum potentialem habet ad quaestiones fundamentales de relatione inter dynamicam et functionem mitochondrialem et quomodo haec morbum afficit tractandas. Maxime autem, TEM methodum directam praebet ad morphologiam mitochondrialem metiendam ut terminum convergens dysfunctionis et dynamicae mitochondrialis51. MEL etiam methodum directam praebet ad eventa fissionis et fusionis in ambitu cellulari tridimensionali visualizanda, permittens quantificationem remodellationis mitochondrialis dynamicae etiam absentibus mutationibus in expressione genorum33. Hic utilitatem technicarum imaginum mitochondrialium in morbis mitochondrialibus secundariis illustramus. Hi morbi typice insigniuntur accentu metabolico chronico levi, qui subtili remodellatione retium mitochondrialium potius quam damno mitochondriali acuto insignitur. Attamen, compensatio mitochondrialis necessaria ad mitosin sub accentu chronico conservandam profundas consequentias functionales habet. In contextu neuroscientiae, melior intellectus horum mechanismorum compensatoriorum informationem magni momenti de neuropathologia pleiotropica cum dysfunctione mitochondriali coniuncta praebere potest.
Denique, nostra data utilitatem technicarum imaginandi ad consequentias functionales interactionum complexarum inter expressionem genorum, modificationes proteinorum, et actionem proteinorum, quae dynamicam mitochondrialem neuronalem regunt, illustrant. PPA adhibuimus ad dysfunctionem mitochondrialem in exemplo cellulae neuronalis imitandam, ut perspicientiam in componentem mitochondrialem ASD adipisceremur. Cellulae SH-SY5Y cum PPA tractatae mutationes in morphologia mitochondriali ostenderunt: mitochondria parva et rotunda facta sunt, et cristae male definitae sunt cum per TEM observatae sunt. Analysis MEL ostendit has mutationes concomitanter cum incremento eventuum fissionis et fusionis occurrere ad rete mitochondriale in responsione ad levem accentum metabolicum conservandum. Praeterea, PPA regulationem transcriptionalem metabolismi mitochondrialis et homeostasis significanter perturbat. cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, et OPA1 ut regulatores mitochondriales clavis a accentu PPA perturbatos identificavimus et partes agere possunt in mediatione mutationum in morphologia et functione mitochondriali a PPA inductarum. Studia futura necessaria sunt ad mutationes temporales a PPA inductas in expressione genorum et actione proteinorum, localizatione, et modificationibus post-translationalibus melius describendas. Nostra data complexitatem et interdependentiam mechanismorum regulantium responsum ad stress mitochondriale mediantium illustrant et utilitatem TEM aliarumque technicarum imaginandi ad studia mechanistica accuratiora demonstrant.
Linea cellularum SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) a Sigma-Aldrich empta est. Cellulae SH-SY5Y in mixtura Dulbecco modificata Eagle's medium/F-12 nutrimentis (DMEM/F-12) et L-glutamino (SC09411, ScienCell) in vasculis 25 cm2 supplementatis cum 20% sero bovino fetali (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) et 1% penicillino-streptomycino (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ad 37°C, 5% CO2 cultae sunt. Cellulae ad 80% confluentiam subcultae sunt utens 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugatae ad 300 g et in patina densitate circiter 7 × 105 cellularum/ml. Omnia experimenta in cellulis SH-SY5Y indifferentiatis inter passages 19–22 peracta sunt. PPA ut NaP administratur. Pulverem NaP (CAS No. 137-40-6, formula chemica C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) in aqua calida MilliQ ad concentrationem 1 M dissolvatur et ad 4°C conservetur. Die curationis, hanc solutionem cum 1 M PPA ad 3 mM et 5 mM PPA in medio sine sero (DMEM/F-12 cum L-glutamino) dilue. Concentrationes curationis pro omnibus experimentis erant nullum PPA (0 mM, control), 3 mM, et 5 mM PPA. Experimenta in saltem tribus replicationibus biologicis peracta sunt.
Cellulae SH-SY5Y in ampullas 25 cm⁻¹ capacitatis, ratione 5.5 × 10⁵ cellularum/ml, seminatae et per 24 horas cultae sunt. Tractatio PPA ampullae ante 24 horas incubationis addita est. Granula cellularia collige secundum protocolla subculturae textuum mammalium consueta (supra descripta). Granulum cellulare in 100 µl glutaraldehydi 2.5%, 1× PBS resuspende et ad 4°C usque ad processum conserva. Cellulae SH-SY5Y breviter centrifugatae sunt ut granula cellularum formarentur et solutio glutaraldehydi 2.5%, 1× PBS removeretur. Sedimentum in gel agarosi 4% in aqua destillata praeparato resuspende (proportio agarosi ad volumen sedimenti est 1:1). Frusta agarosi in craticulis in laminis planis posita et 1-hexadeceno ante congelationem sub alta pressione obducta sunt. Exempla in acetono sicco 100% ad -90°C per 24 horas congelata sunt. Temperatura deinde ad -80°C elevata est et solutio 1% osmii tetroxidi et 0.1% glutaraldehydi addita est. Exempla ad -80°C per 24 horas conservata sunt. Post hoc, temperatura gradatim ad temperaturam ambientem per aliquot dies aucta est: a –80°C ad –50°C per 24 horas, ad –30°C per 24 horas, ad –10°C per 24 horas, et denique ad temperaturam ambientem.
Post praeparationem cryogenicam, exempla resina imbuta sunt et sectiones tenuissimae (∼100 nm) per ultramicrotomum Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) factae sunt. Sectiones 2% uranyl acetato et plumbo citrato tinctae sunt. Exempla observata sunt per microscopium electronicum transmissionis FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (olim FEI), Eindhoven, Nederlandia) operantem ad 200 kV (transmissor Lab6) et cameram Gatan CCD (Gatan, UK) instructam filtro energiae Tridiem.
In unaquaque replicatione technica, saltem XXIV imagines cellularum singularum acquisitae sunt, in summa CCXVI imaginum. Omnes imagines per macro Region of Interest (ROI) et macro Mitochondriorum analysatae sunt. Macro mitochondriale in methodis publicatis17,31,32 fundatur et processum semi-automaticum imaginum TEM in Fiji/ImageJ69 permittit. In nuce: imago invertitur et invertitur utens subtractione globi volubilis (radio 60 pixellorum) et filtro FFT bandpass (limitibus superioribus et inferioribus 60 et 8 pixellorum respective utens) et suppressione lineae verticalis cum tolerantia orientationis 5%. Imago processa automatice limine definito utens algorithmo maximae entropiae et larva binaria generatur. Regiones imaginum cum ROI manualiter selectis in imaginibus TEM crudis associatae extractae sunt, mitochondria describentes et membranam plasmaticam aliasque regiones magni contrastus excludentes. Pro singulis regionibus investitionis (ROI) extractis, particulae binariae maiores quam 600 elementa elementaria analysatae sunt, et area particularum, perimeter, axes maior et minor, diameter Feret, rotunditas, et circularitas mensuratae sunt utens functionibus mensurae insitis Fiji/ImageJ. Secundum Merrill, Flippo, et Strack (2017), area 2, proportio aspectus particularum (proportio axis maioris ad minorem), et factor formae (FF) ex his datis calculati sunt, ubi FF = perimeter 2/4pi x area. Definitio formulae parametricae inveniri potest apud Merrill, Flippo, et Strack (2017). Macros commemorati in GitHub praesto sunt (vide Declarationem Disponibilitatis Datorum). Mediocriter, circiter 5600 particulae per curationem PPA analysatae sunt, pro summa circiter 17000 particularum (data non exhibita).
Cellulae SH-SH5Y in patellis culturae octo camerarum (ThermoFisher, #155411) collocatae sunt ut per noctem adhaesio permitteretur, deinde cum TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) et Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) incubatae sunt. Imagines acquisitae sunt laseribus 405 nm et 561 nm per decem minuta, et imagines crudae acquisitae sunt ut acervi z continentes decem micrographas imaginum cum gradu az 0.2 μm inter imagines imaginum ad duodecim puncta temporalia subsequentia. Imagines collectae sunt suggestu super-resolutionis Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) utens lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Imagines in ImageJ analysatae sunt, utens canali antea descripto et modulo ImageJ ad mensurandum eventus fusionis et fissionis, numerum medium structurarum mitochondrialium, et volumen medium mitochondriale per cellulam33. Macros MEL in GitHub praesto sunt (vide Declarationem Disponibilitatis Datorum).
Cellulae SH-SY5Y in laminis sex puteorum densitate 0.3 × 10⁶ cellularum/mL per 24 horas ante curationem creverunt. RNA extracta est utens protocollo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) cum levibus modificationibus: adde 300 μl solutionis RNA lysis in singulos puteos ante remotionem et lysare unumquodque exemplum ut gradum finalem cum 30 μl elutionis DNase/RNase. Aqua sine DNase. Omnia exempla pro quantitate et qualitate examinata sunt utens Spectrophotometro UV-Vis NanoDrop ND-1000. Proteinum totale ex lysatis cellularum obtentum est utens 200 μl solutionis RIPA lysis, et concentratio proteini quantificata est utens probatione proteini Bradford70.
Synthesis cDNA peracta est utens Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) secundum instructiones fabricatoris cum quibusdam modificationibus. cDNA synthesizatum est in reactionibus 20 μl utens 0.7 ad 1 μg RNA totalis. Initiatores selecti sunt ex chartis antea editis 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabula S1) et probae comitantes designatae sunt utens instrumento PrimerQuest ab Integrated DNA Technologies. Omnia gena interest ad gen nucleare B2M normalizata sunt. Expressio genorum STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC et OPA1 mensurata est per RT-qPCR. Mixtura principalis LUNA Taq polymerasem (M3003L, New England Biolabs), 10 μM initiatores anteriores et posteriores, cDNA, et aquam PCR-gradus continebat, ut volumen finale 10 μL pro unaquaque reactione obtineretur. Expressio genorum divisionis et fissionis (DRP1, MFN1/2) per probationes multiplex TaqMan mensurata est. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) secundum instructiones fabricatoris cum modificationibus minoribus adhibita est. Mixtura principalis RT-qPCR multiplex 1X LUNA Taq polymerasem, 10 μM initiatores anteriores et posteriores, 10 μM specillum, cDNA, et aquam PCR-gradus continet, ut volumen finale 20 μL pro unaquaque reactione obtineretur. RT-qPCR per Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—numerus serialis: R0618110) peracta est. Conditiones cyclicae in Tabula S1 monstrantur. Omnia exempla cDNA triplicate amplificata sunt et curva norma generata est utens serie dilutionum decuplatarum. Valores aberrantes in exemplis triplicatis cum deviatione norma liminis cycli (Ct) >0.5 ex analysi remoti sunt ad reproducibilitatem datorum confirmandam30,72. Expressio genorum relativa calculata est utens methodo 2-ΔΔCt79.
Exempla proteinorum (60 μg) cum liquore Laemmli onerando proportione 2:1 mixta sunt et in gel proteinorum incolore 12% (Bio-Rad #1610184) currebantur. Proteina in membranam PVDF (polyvinylideni fluoridi) (#170-84156, Bio-Rad) translata sunt, systemate Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad) utens. Membrana obstructa est et cum anticorporibus primariis idoneis (OPA1, MFN1, MFN2, et DRP1) (dilutis 1:1000) per 48 horas incubata, deinde cum anticorporibus secundariis (1:10,000) per 1 horam incubata. Membranae deinde imagines captae sunt utens Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) et utens systemate Bio-Rad ChemiDoc MP notatae. ImageLab versio 6.1 ad analysin Western blot adhibita est. Gel et macula originalia in Figura S1 monstrantur. Informationes de anticorporibus in Tabula S2 praebentur.
Data collectiones exhibentur ut media et error standard mediae (SEM) saltem trium exemplorum independentium. Data collectiones pro normalitate examinatae sunt utens probatione Shapiro-Wilks (nisi aliter dictum est) antequam distributionem Gaussianam et deviationes standard aequales assumerentur et cum analysibus procederetur. Praeterea data collectionem analysis facta est utens Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA unidirectionali (media tractationis contra mediam controlis), et probatione comparationis multiplici Dunnett ad significantiam determinandam (p < 0.05). Valores p significantes in graphico monstrantur ut *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Omnes analyses statisticae et graphica peracta et generata sunt utens GraphPad Prism 9.4.0.
Macros Fiji/ImageJ ad imaginum TEM analysin publice in GitHub praesto sunt: ​​https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Macro Locatoris Eventuum Mitochondrialium (MEL) publice in GitHub praesto est: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM et Vijaya A. Mitochondria: regulatores principales metabolismi, homeostasis, accentus, senescendi et epigeneticae. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. *Disfunctio mitochondrialis multiplex in schizophrenia, complexus I ut scopus pathologicus possibilis.* Schizophrenia. *Resource*. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. et Beal, MF. Dysfunctio mitochondrialis in morbo Parkinsoniano. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG et Mehta V. Mitochondria stressata: scopi invasionis in morbo Alzheimeriano. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF et Ferreira GK. Mitochondria et cerebrum: bioenergetica et plura. Neurotoxina. *Resource* 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitochondria pleiotropica: effectus mitochondriorum in evolutionem neuronalem et morbos. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. et Morais, VA. Biogenesis mitochondrialis in neuronibus: quomodo et ubi. Internationalitas. J. Mohr. Scientia. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. et Zhao, J. *Moderatio dynamicae mitochondrialis mammalium: opportunitates et difficultates*. *Front*. *Endocrine*. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. et Slack, RS Dynamica mitochondrialis in ordinatione neurogenesis: a cerebro in evolutione ad cerebrum adultum. Development. Dynamica. 247, 47–53 (2018).