Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem pro CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro renovato utaris (aut modum compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut continua sustentatio praestetur, situm sine stylis et JavaScript demonstrabimus.
Nanoparticulae insulini (NP) cum alto onere varias applicationes in diversis formis medicamentorum invenerunt. Hoc opus propositum habet aestimare effectum processuum congelationis-siccationis et nebulae-siccationis in structuram nanoparticularum chitosani insulina oneratorum, cum vel sine mannitolo ut cryoprotectore. Qualitatem harum nanoparticularum etiam per redissolutionem earum aestimavimus. Ante dehydrationem, magnitudo particularum nanoparticularum chitosani/natrii tripolyphosphatis/insulinae reticulatarum ad 318 nm optimizata est, PDI 0.18 erat, efficientia encapsulationis 99.4% erat, et oneratio 25.01% erat. Post reconstitutionem, omnes nanoparticulae, praeter eas quae per methodum congelationis-siccationis sine usu mannitoli productae sunt, structuram sphaericam particularum retinuerunt. Comparatae cum nanoparticulis mannitolo continentibus per nebulam dehydratis, nanoparticulae nebulae-siccationis sine mannitolo etiam minimam magnitudinem mediam particularum (376 nm) et maximum onus-contentum ostenderunt. (25.02%) cum simili ratione encapsulationis (98.7%) et PDI (0.20) per exsiccationem vel congelationem-siccationem. Nanoparticulae exsiccatae per exsiccationem per pulverizationem sine mannitolo etiam celerrimam liberationem insulini et maximam efficaciam absorptionis cellularis effecerunt. Hoc opus demonstrat exsiccationem per pulverizationem nanoparticulas insulini dehydratare posse sine necessitate cryoprotectorum comparatam cum methodis congelationis-siccationis conventionalibus, creando maiorem capacitatem oneris, minores requisita additivorum et commodum significans sumptuum operandi.
Ex quo anno 1922 inventum est1,2,3, insulinum et eius praeparationes pharmaceuticae vitas aegrotorum diabete typo 1 (T1DM) et diabete typo 2 (T1DM) affectorum servaverunt. Attamen, propter proprietates suas ut proteinum magni ponderis molecularis, insulinum facile aggregatur, per enzyma proteolytica dissolvitur, et per effectum primi transitus eliminatur. Homines diabete typo 1 affecti injectiones insulini per totam vitam requirunt. Multi aegroti initio diabete typo 2 affecti etiam injectiones insulini diuturnas requirunt. Injectiones insulini quotidianae fons gravis doloris et molestiae quotidianae his individuis sunt, cum effectibus negativis in salutem mentalem. Propterea, aliae formae administrationis insulini quae minus molestiae causant, ut administratio insulini oralis, late investigantur5 quia potentiam habent qualitatem vitae circiter 5 miliardorum hominum diabete affectorum toto orbe terrarum restituendi.
Technologia nanoparticularum progressum magnum praebuit in conatibus insulinum oralem sumi4,6,7. Technologia quae insulinum efficaciter includit et a degradatione protegit ad distributionem directam ad loca corporis specifica. Attamen usus formularum nanoparticularum nonnullas limitationes habet, praesertim propter problemata stabilitatis suspensionum particularum. Quaedam aggregatio fieri potest durante conservatione, quae biodisponibilitatem nanoparticularum insulino onustarum8 minuit. Praeterea, stabilitas chemica matricis polymericae nanoparticularum et insulini etiam consideranda est ad stabilitatem nanoparticularum insulini (NP) confirmandam. Hodie, technologia congelationis-siccationis est norma optima ad NP stabiles creandas, mutationes non desideratas durante conservatione9 prohibendo.
Attamen, exsiccatio per congelationem additionem cryoprotectorum requirit ne structura sphaerica nanoparticulorum afficiatur a tensione mechanica crystallorum glaciei. Hoc onus nanoparticulorum insulini post lyophilizationem significanter minuit, cum cryoprotector maximam partem rationis ponderis occupet. Ergo, nanoparticulae insulini productae saepe inveniuntur ineptae ad fabricationem formulationum pulveris sicci, ut tabularum oralium et pellicularum oralium, propter necessitatem magnarum quantitatum nanoparticulorum sicci ad fenestram therapeuticam insulini attingendam.
Exsiccatio per pulverizationem est processus notus et vilis scalae industrialis ad producenda pulveres siccos ex phasibus liquidis in industria pharmaceutica10,11. Imperium super processum formationis particularum permittit encapsulationem propriam plurium compositorum bioactivorum12, 13. Praeterea, facta est ars efficax ad praeparationem proteinorum encapsulatorum ad administrationem oralem. Durante exsiccatione per pulverizationem, aqua celerrime evaporat, quod adiuvat ad temperaturam nuclei particularum humilem conservandam11,14, permittens applicationem eius ad encapsulanda elementa calori sensibilia. Ante exsiccationem per pulverizationem, materia tegumenti debet perfecte homogenizata esse cum solutione continente ingredientia encapsulata11,14. Dissimiliter exsiccationi congelationis, homogenizatio ante encapsulationem in exsiccatione per pulverizationem auget efficaciam encapsulationis durante dehydratione. Cum processus encapsulationis per pulverizationem non requirat cryoprotectores, exsiccatio per pulverizationem adhiberi potest ad producendas nanoparticulas siccas cum alto contento oneris.
Hoc studium productionem nanoparticulorum insulinico onustarum per nexum transversam chitosani et natrii tripolyphosphatis utens methodo geli ionici refert. Gelatio ionica est methodus praeparationis quae productionem nanoparticulorum per interactiones electrostaticas inter duas vel plures species ionicas sub certis condicionibus permittit. Tam technicae lyophilizationis quam exsiccationis per pulverizationem adhibitae sunt ad nanoparticulas chitosani/natrii tripolyphosphatis/insulinicas optimizatas et nexu transversas dehydratandas. Post dehydrationem, morphologia earum per SEM analysata est. Capacitas recombinationis earum aestimata est mensurando distributionem magnitudinis, onus superficiale, PDI, efficientiam encapsulationis, et contentum oneris. Qualitas nanoparticularum resolubilizatarum per varias methodos dehydrationis productorum etiam aestimata est comparando protectionem insulini, modum liberationis, et efficaciam absorptionis cellularis.
pH solutionis mixtae et proportio chitosani et insulini duo factores clavis sunt qui magnitudinem particularum et efficaciam encapsulationis (EE) nanoparticulorum finalium afficiunt, cum directe processum gelationis ionotropicae afficiant. pH solutionis mixtae valde cum magnitudine particularum et efficacia encapsulationis correlatum esse demonstratum est (Fig. 1a). Ut in Fig. 1a ostenditur, cum pH a 4.0 ad 6.0 augebatur, magnitudo particularum media (nm) decrevit et EE significanter augebatur, dum cum pH ad 6.5 augebatur, magnitudo particularum media crescere coepit et EE immutata mansit. Cum proportio chitosani ad insulini augetur, magnitudo particularum media etiam augetur. Praeterea, nulla mutatio in EE observata est cum nanoparticulae praeparatae sunt ad proportionem massae chitosani/insulinae maiorem quam 2.5:1 (w/w) (Fig. 1b). Ergo, condiciones optimae praeparationis in hoc studio (pH 6.0, proportio massae chitosani/insulinae 2.5:1) adhibitae sunt. Ad nanoparticulas insulinicas onustas ad ulteriorem studium praeparandas. Sub hac condicione praeparationis, magnitudo media particularum nanoparticularum insulinicam ad 318 nm (Fig. 1c) optimizata est, PDI 0.18, efficientia inclusionis 99.4%, potentiale zeta 9.8 mv, et onus insulinicum 25.01% (m/m) erat. Secundum resultata microscopiae electronicae transmissionis (TEM), nanoparticulae optimizatae erant fere sphaericae et discretae cum magnitudine relative uniformi (Fig. 1d).
Optimizatio parametrorum nanoparticularum insulini: (a) effectus pH in diametrum medium et efficaciam encapsulationis (EE) nanoparticularum insulini (paratarum ad proportionem massae 5:1 chitosani et insulini); (b) chitosanum et influxus proportionis massae insulini in diametrum medium et efficaciam encapsulationis (EE) nanoparticularum insulini (paratarum ad pH 6); (c) distributio magnitudinis particularum nanoparticularum insulini optimizatarum; (d) micrographia TEM nanoparticularum insulini optimizatarum.
Constat chitosanum esse polyelectrolytum debile cum pKa 6.5. Positive oneratum est in mediis acidis quia eius principale amino grex ab ionibus hydrogenii protonatur15. Quapropter saepe ut vector ad macromoleculas negative oneratas includendas adhibetur. In hoc studio, chitosanum ad insulinum includendum cum puncto isoelectrico 5.3 adhibitum est. Cum chitosanum ut materia tegumenti adhibeatur, cum eius proportione augetur, crassitudo strati exterioris nanoparticularum correspondenter augetur, quod magnitudinem mediam particularum maiorem efficit. Praeterea, altiores gradus chitosani plus insulini includere possunt. In nostro casu, EE maxima erat cum proportio chitosani et insulini 2.5:1 attigit, et nulla mutatio significativa in EE facta est cum proportio crescere pergebat.
Praeter proportionem chitosani et insulini, pH etiam partes cruciales in praeparatione nanoparticulorum egit. Gan et al. [17] effectum pH in magnitudinem particularum nanoparticulorum chitosani investigaverunt. Continuam diminutionem magnitudinis particularum invenerunt donec pH ad 6.0 pervenit, et significans augmentum magnitudinis particularum observatum est ad pH > 6.0, quod cum nostris observationibus congruit. Hoc phaenomenon ex eo oritur quod, pH crescente, molecula insulini negativam superficiem oneris acquirit, ita interactiones electrostaticas cum complexo chitosani/natrii tripolyphosphatis (TPP) favens, quod parvam magnitudinem particularum et magnum EE efficit. Attamen, cum pH ad 6.5 aptatum est, greges amini in chitosano deprotonati sunt, quod plicaturam chitosani efficit. Ergo, pH altum minorem expositionem ionum amini ad TPP et insulini efficit, quod minorem reticulationem, maiorem magnitudinem mediam particularum finalem et minorem EE efficit.
Analysis proprietatum morphologicarum nanoparticulis (NP) congelatis et per pulverizationem siccatarum electionem meliorum methodorum dehydrationis et formationis pulveris dirigere potest. Methodus praeferenda stabilitatem medicamenti, formam uniformem particularum, magnum onus medicamenti et bonam solubilitatem in solutione originali praebere debet. In hoc studio, ad melius comparandas duas methodos, NP insulini cum vel sine 1% mannitolo per dehydrationem adhibitae sunt. Mannitolo ut agens amplificans vel cryoprotector in variis formulationibus pulveris sicci ad congelationem et per pulverizationem siccationem adhibetur. Pro nanoparticulis insulini lyophilizatis sine mannitolo, ut in Figura 2a monstratur, structura pulveris valde porosa cum superficiebus magnis, irregularibus et asperis sub microscopio electronico scanning (SEM) observata est. Paucae particulae discretae in pulvere post dehydrationem detectae sunt (Fig. 2e). Haec eventa indicaverunt plerasque NP per congelationem sine ullo cryoprotectore decompositas esse. Pro nanoparticulis insulini congelatis et per pulverizationem siccatis 1% mannitolo continentibus, nanoparticulis sphaericis cum superficiebus levibus observatae sunt (Fig. 2b, d, f, h). Nanoparticulae insulini sine mannitolo per pulverizationem siccatae sphaericae manebant sed in superficie rugosae (Fig. 2c). Superficies sphaericae et rugosae ulterius in probationibus de modo liberationis et absorptionis cellularis infra tractantur. Secundum aspectum visibilem nanoparticulorum siccatarum, et nanoparticulae per pulverizationem siccatae sine mannitolo et nanoparticulae per congelationem et per pulverizationem siccatae cum mannitolo pulveres nanoparticulorum tenues protulerunt (Fig. 2f, g, h). Quo maior area superficialis inter superficies particularum, eo maior solubilitas et ergo eo maior celeritas liberationis.
Morphologia diversarum nanoparticulorum insulinae dehydratarum: (a) imago SEM nanoparticulorum insulinae lyophilizatarum sine mannitolo; (b) imago SEM nanoparticulorum insulinae lyophilizatarum cum mannitolo; (c) nanoparticulae insulinae pulveris exsiccatae sine mannitolo; imago SEM nanoparticulorum insulinae pulveris exsiccatarum cum mannitolo; (e) imago pulveris nanoparticulorum insulinae lyophilizatarum sine mannitolo; (f) imago nanoparticulorum insulinae lyophilizatarum cum mannitolo; (g) imago pulveris nanoparticulorum insulinae pulveris exsiccatae sine mannitolo; (h) imago pulveris nanoparticulorum insulinae pulveris exsiccatae cum mannitolo.
Per congelationem-exsiccationem, mannitolum fungitur ut cryoprotector, nanoparticulas in forma amorpha servans et damnum a crystallis glaciei prohibens19. Contra, nullus gradus congelationis est per exsiccationem per pulverizationem. Ergo mannitolum non requiritur in hac methodo. Re vera, nanoparticulae per pulverizationem exsiccatae sine mannitolum nanoparticulas subtiliores protulerunt, ut antea descriptum est. Attamen, mannitolum adhuc fungi potest ut implens in processu exsiccationis per pulverizationem ut nanoparticulis structuram magis sphaericam det20 (Fig. 2d), quod adiuvat ad uniformem modum liberationis talium nanoparticulorum inclusarum obtinendum. Praeterea, manifestum est quasdam particulas magnas detegi posse in nanoparticulis insulinae tam congelation-exsiccatis quam per pulverizationem exsiccatis mannitolum continentibus (Fig. 2b,d), quod fortasse ob accumulationem mannitoli in nucleo particularum una cum insulina inclusa oritur. Ad stratum chitosani. Notandum est in hoc studio, ut structura sphaerica post dehydrationem integra maneat, rationem mannitoli et chitosani ad 5:1 servari, ita ut magna copia impletionis etiam magnitudinem particularum nanoparticulorum siccatarum augere possit.
Spectroscopia Fourier Transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) mixturam physicam insulini liberi, chitosani, chitosani, TPP et insulini descripsit. Omnes nanoparticulae dehydratae per spectroscopiam FTIR-ATR descriptae sunt. Notandum est intensitates fasciarum 1641, 1543 et 1412 cm⁻¹ in nanoparticulis encapsulatis mannitolo congelatis et in nanoparticulis cum et sine mannitolo pulverisato (Fig. 3) observatas esse. Ut antea relatum est, hae augmentationes roboris cum nexu inter chitosanum, TPP et insulinum coniunctae sunt. Investigatio interactionis inter chitosanum et insulinum demonstravit in spectris FTIR nanoparticulorum chitosani insulino onustorum, fasciam chitosani cum fascia insulini se texisse, intensitatem carbonyl (1641 cm⁻¹) et zonam aminae (1543 cm⁻¹) augens. Greges tripolyphosphati TPP cum gregibus ammonii in chitosano coniunguntur. fasciam formans ad 1412 cm⁻¹.
Spectra FTIR-ATR insulini liberi, chitosani, mixturarum physicarum chitosani/TPP/insulini et nanoparticulorum (NP) variis methodis dehydratarum.
Praeterea, haec eventa congruunt cum illis quae in SEM demonstrata sunt, quae demonstraverunt nanoparticulas inclusas integras mansisse et cum mannitolo aspersae et congelatae exsiccantur, sed absente mannitolo, sola exsiccatio per pulverizationem particulas inclusas produxit. Contra, eventa spectralia FTIR-ATR nanoparticulorum congelatarum sine mannitolo valde similia erant mixturae physicae chitosani, TPP, et insulini. Hoc eventum indicat nexus inter chitosanum, TPP et insulini iam non adesse in nanoparticulis congelatis sine mannitolo. Structura nanoparticulorum destructa est durante congelatione sine cryoprotectorio, quod in eventibus SEM videri potest (Fig. 2a). Fundata in morphologia et eventibus FTIR nanoparticulorum insulini dehydratarum, solae nanoparticulae lyophilizatae, congelatae exsiccatae, et sine mannitolo ad experimenta reconstitutionis et sine mannitolo adhibitae sunt propter decompositionem nanoparticulorum sine mannitolo durante dehydratione. Discute.
Dehydratio ad diuturnam conservationem et ad alias formulationes reprocessandum adhibetur. Facultas nanoparticulorum siccorum ad reconstituendum post conservationem critica est ad usum earum in variis formulis, ut in tabulis et pelliculis. Animadvertimus magnitudinem mediam particularum nanoparticulorum insulini per pulverizationem siccatarum, absente mannitolo, tantum leviter auctam esse post reconstitutionem. Contra, magnitudo particularum nanoparticulorum insulini per pulverizationem siccatarum et congelatarum cum mannitolo significanter aucta est (Tabula 1). PDI et EE non significanter mutatae sunt (p > 0.05) post recombinationem omnium NP in hoc studio (Tabula 1). Hoc resultat indicat plerasque particulas integras mansisse post redissolutionem. Attamen, additio mannitol effecit ut onus insulini valde redactum esset in nanoparticulis mannitol lyophilizatis et per pulverizationem siccatis (Tabula 1). Contra, contentum oneris insulini NP per pulverizationem siccatarum sine mannitolo idem mansit ac antea (Tabula 1).
Bene notum est onus nanoparticularum magni momenti esse cum ad medicamentorum administrationem adhibentur. Pro nanoparticulis (NP) cum oneribus parvis, magnae materiae quantitates requiruntur ad limen therapeuticum attingendum. Attamen, alta viscositas talium altarum NP concentrationum ad incommodum et difficultatem in administratione orali et formulis iniectabilibus, respective, ducit. Praeterea, NP insulini etiam ad tabulas et biopelliculas viscosas faciendas adhiberi possunt, quod usum magnarum quantitatum NP cum oneribus parvis requirit, quod in magnis tabellis et biopelliculis crassis resultat quae ad applicationes orales non aptae sunt. Ergo, NP dehydratae cum alto onere insulini valde desiderantur. Nostrae conclusiones suggerunt magnum onus insulini NP exsiccatarum per pulverizationem sine mannitolo multa commoda attractiva pro his modis administrationis alternativis offerre posse.
Omnes nanoparticulae dehydratae in armario frigidario per tres menses servatae sunt. Resultata microscopiae electronicae per microscopium electronicum (SEM) demonstraverunt morphologiam omnium nanoparticularum dehydratarum non significanter mutatam esse per tres menses conservationis (Fig. 4). Post reconstitutionem in aqua, omnes nanoparticulae levem diminutionem in EE ostenderunt et circiter parvam quantitatem (~5%) insulini per tres menses conservationis emiserunt (Tabula 2). Attamen, magnitudo particularum media omnium nanoparticularum aucta est. Magnitudo particularum nanoparticularum sine mannitolo per aspersionem siccatarum ad 525 nm crevit, dum magnitudo particularum nanoparticularum per aspersionem siccatarum et per congelationem siccatarum cum mannitolo ad 872 et 921 nm respective crevit (Tabula 2).
Morphologia diversarum nanoparticulorum insulinae dehydratarum per tres menses conservatarum: (a) Imago SEM nanoparticulorum insulinae lyophilizatarum cum mannitolo; (b) Imago SEM nanoparticulorum insulinae per pulverizationem siccatarum sine mannitolo; (c) Imagines SEM nanoparticulorum insulinae per pulverizationem siccatarum sine mannitolo.
Praeterea, praecipitata in nanoparticulis insulini reconstitutis, mannitolo per aspersionem siccatis et lyophilizatis (Fig. S2), visa sunt. Hoc fortasse a magnis particulis in aqua non recte suspensis causatur. Omnia supradicta demonstrant technicam exsiccationis per aspersionem nanoparticulis insulini a dehydratione protegere posse et magnas onera nanoparticulis insulini sine ullis impletionibus vel cryoprotectoriis obtineri posse.
Retentio insulini in medio pH = 2.5 cum pepsino, trypsino, et α-chymotrypsino probata est ad vim protectivam nanoparticulorum contra digestionem enzymaticam post dehydrationem demonstrandam. Retentio insulini nanoparticulorum dehydratarum cum ea nanoparticulorum recens praeparatarum comparata est, et insulinum liberum ut negativum control adhibitum est. In hoc studio, insulinum liberum eliminationem insulini celerem intra 4 horas in omnibus tribus curationibus enzymaticis ostendit (Fig. 5a-c). Contra, probatio eliminationis insulini nanoparticulorum cum mannitolo congelatae et nanoparticulorum cum vel sine mannitolo per aspersionem siccatarum significanter maiorem protectionem harum nanoparticulorum contra digestionem enzymaticam ostendit, quae similis erat ei nanoparticulorum insulini recens praeparatarum (figura 1).5a-c). Auxilio nanoparticulorum in pepsino, trypsino, et α-chymotrypsino, plus quam 50%, 60%, et 75% insulini intra 4 horas, respective, protegi potuit (Fig. 5a-c). Haec protectio insulinica... Haec facultas fortasse auget probabilitatem maioris absorptionis insulini in sanguinem25. Haec eventa suggerunt exsiccationem per pulverizationem cum vel sine mannitolo et exsiccationem per congelationem cum mannitolo posse facultatem protectionis insulinicae nanoparticulorum post dehydrationem conservare.
Protectio et modus liberationis nanoparticulorum insulinae dehydratarum: (a) protectio insulinae in solutione pepsini; (b) protectio insulinae in solutione trypsini; (c) protectio insulinae per solutionem α-chymotrypsini; (d) Modus liberationis NP dehydratarum in solutione pH = 2.5; (e) modus liberationis NP dehydratarum in solutione pH = 6.6; (f) modus liberationis NP dehydratarum in solutione pH = 7.0.
Nanoparticulae insulini siccae, recens paratae et reconstitutae, in variis solutionibus tamponatis (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ad 37°C incubatae sunt, pH ambitum stomachi, duodeni, et intestini tenuis superioris simulantes, ut effectus insulini in resistentiam insulini examinaretur. Modus emissionis in diversis ambitus. Fragmentum tractus gastrointestinalis. Ad pH = 2.5, nanoparticulae insulinicae onustae et nanoparticulae insulinicae siccae resolubilisatae emissionem initialem eruptionis intra primam horam ostenderunt, deinde emissionem lentem per proximas 5 horas (Fig. 5d). Haec rapida emissio initio probabilissime ex rapida desorptione superficiali molecularum proteinicorum oritur quae non plene immobilizatae sunt in structura interna particulae. Ad pH = 6.5, nanoparticulae insulinicae onustae et nanoparticulae insulinicae siccae reconstitutae emissionem lenem et lenem per 6 horas ostenderunt, cum pH solutionis probatae simile erat ei solutionis nanoparticulae praeparatae (Fig. 5e). Ad pH = 7, nanoparticulae instabiles erant et fere omnino intra primas duas horas decompositae sunt (Fig. 5f). Hoc fit quia deprotonatio chitosani ad pH altiore fit, quod in reticulo polymerico minus compacto et emissione insulini onusti evenit.
Praeterea, nanoparticulae insulinae sine mannitolo per pulverizationem siccatae celeriorem liberationem ostenderunt quam aliae nanoparticulae dehydratae (Fig. 5d-f). Ut antea descriptum est, nanoparticulae insulinae reconstitutae sine mannitolo siccatae minimam magnitudinem particularum ostenderunt. Particulae parvae maiorem superficiem praebent, ita maxima pars medicamenti pertinentis ad vel prope superficiem particularum erit, quod celerem liberationem medicamenti efficit.
Cytotoxicitas nanoparticulorum (NP) per MTT analysin investigata est. Ut in Figura S4 demonstratur, omnes NP dehydratae nullum effectum significantem in cellularum viabilitatem in concentrationibus 50-500 μg/ml habere inventae sunt, quod suggerit omnes NP dehydratas tuto ad fenestram therapeuticam perveniendam adhiberi posse.
Iecur est organum principale per quod insulinum functiones suas physiologicas exercet. Cellulae HepG2 sunt stirps cellularum hepatomatis humani, vulgo adhibita ut exemplar absorptionis hepatocytorum in vitro. Hic, cellulae HepG2 adhibitae sunt ad absorptionem cellularem nanoparticulorum (NP) dehydratarum per methodos congelationis-siccationis et pulverisationis-siccationis aestimandam. Absorptio cellularis per confocalem laser scanning utens cytometria fluxus et visione post aliquot horas incubationis cum insulino FITC libero ad concentrationem 25 μg/mL, NP insulino FITC onustis recens praeparatis et NP insulino FITC onustis dehydratis ad aequales concentrationes insulini. Observationes microscopiae quantitativae (CLSM) peractae sunt. NP lyophilizatae sine mannitolo per dehydrationem destructae sunt et in hoc experimento non aestimatae sunt. Intensitates fluorescentiae intracellularis NP insulino onustis recens praeparatarum, NP lyophilizatarum cum mannitolo, et NP pulverisationis-siccatorum cum et sine mannitolo (Fig. 6a) erant 4.3, 2.6, 2.4,... et 4.1-pliciter altiores quam liberae. Grex FITC-insulinae, respective (Fig. 6b). Haec eventa suggerunt insulinam inclusam potentiorem esse in absorptione cellulari quam insulinam liberam, praesertim propter minorem magnitudinem nanoparticularum insulina onustarum in studio productarum.
Absorptio cellularum HepG2 post incubationem 4 horarum cum nanoparticulis recens praeparatis et nanoparticulis dehydratis: (a) Distributio absorptionis insulinae FITC a cellulis HepG2. (b) Media geometrica intensitatum fluorescentiae per cytometriam fluxus analysata (n = 3), *P < 0.05 comparata cum insulina libera.
Similiter, imagines CLSM demonstraverunt intensitates fluorescentiae FITC nanoparticulorum (NP) recens praeparatarum, FITC-insulina onustarum, et NP atomizatione-siccatorum (sine mannitolo) multo fortiores esse quam eas aliorum exemplorum (Fig. 6a). Praeterea, addito mannitolo, viscositas maior solutionis resistentiam absorptioni cellulari auxit, quod proliferationem insulini minuit. Haec eventa suggerunt NP atomizatione-siccatas sine mannitolo maximam efficaciam absorptionis cellularis exhibuisse, quia magnitudo particularum earum minor erat quam NP congelatarum post redissolutionem.
Chitosanum (pondus moleculare medium 100 KDa, 75-85% deacetylatum) a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) emptum est. Natrii tripolyphosphas (TPP) a VWR (Radnor, Pennsylvania, USA) emptum est. Insulina humana recombinans in hoc studio adhibita a Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) fuit. Insulina humana fluorescein isothiocyanate (FITC) notata et 4',6-diamidino-2-phenylindoli dihydrochloridum (DAPI) a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) empta sunt. Linea cellularum HepG2 ab ATCC (Manassas, Virginia, USA) obtenta est. Cetera omnia reagentia gradus analytici vel chromatographici erant.
Solutionem CS 1 mg/ml para, eam in aqua bis distillata (aqua DD) continenti 0.1% acidi acetici dissolvendo. Solutiones 1 mg/ml TPP et insulini para, eas in aqua DD et 0.1% acido acetico respective dissolvendo. Praeemulsio cum homogenizatore celerrimo polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) parata est. Processus praeparationis est ut sequitur: primo, 2ml solutionis TPP ad 4ml solutionis insulini adduntur, et mixtura per 30 min agitatur et plene mixta est. Deinde, solutio mixta guttatim solutioni CS per syringam sub agitatione celerrima (10,000 rpm) addita est. Mixturae sub agitatione celerrima (15,000 rpm) in balneo glaciali per 30 min servatae sunt, et ad certum pH adaptatae sunt ut nanoparticulae insulini reticulatae obtinerentur. Ad ulterius homogenizandum et magnitudinem particularum nanoparticulorum insulini reducendam, sonicatae sunt... per triginta minuta amplius in balneo glaciali sonicatore generis specilli (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germania) utens.
Novae substantiae insulinae (NSP) pro diametro medio Z, indice polydispersitatis (PDI), et potentiali zeta examinatae sunt per mensuras dispersionis lucis dynamicae (DLS) instrumento Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluendo in aqua DD ad 25°C. Morphologia et distributio magnitudinis microscopio electronico transmissionis (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Iaponia) descriptae sunt, et imagines deinde programmate Hitachi imaginum (Hitachi, Tokyo, Iaponia) analysatae sunt. Ad efficientiam encapsulationis (EE) et capacitatem oneris (LC) NP insulini aestimandam, NP in tubos ultrafiltrationis cum limite ponderis molecularis 100 kDa pipetta immissae et ad 500 xg per 30 min centrifugatae sunt. Insulinum non incapsulatum in filtrato quantificatum est systemate HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, California, USA) consistente ex antlia quaternaria, autosampler, calefactore columnae, ... et detector DAD. Insulina per columnam C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) analysata est et ad 214 nm detecta. Phase mobilis erat acetonitrilum et aqua, continens 0.1% TFA, proportionibus gradientium ab 10/90 ad 100/0, et per 10 minuta currebat. Phase mobilis cum fluxu 1.0 ml/min pumpata est. Temperatura columnae ad 20°C constituta est. Percentationes EE et LC utens aequationibus (1) et Aeq. (2) computa.
Variae proportiones CS/insulinae, a 2.0 ad 4.0, ad nanoparticulas insulinae optimizandas examinatae sunt. Diversae quantitates solutionis CS per praeparationem additae sunt, mixtura insulinae/TPP constans manente. Nanoparticulae insulinae in pH inter 4.0 et 6.5 praeparatae sunt, pH mixturae diligenter moderando post additionem omnium solutionum (insulinae, TPP et CS). Excessus energiae (EE) et magnitudo particularum nanoparticularum insulinae ad varia pH et proportiones massae CS/insulinae aestimatae sunt ad formationem nanoparticularum insulinae optimizandam.
Nanoparticulae insulinae optimizatae in vase aluminio positae et charta textili taenia quadam constricta tectae sunt. Deinde, vasa cochleata in siccatorem congelationis Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) cum siccatore cum ferculo instructum collocata sunt. Temperatura et pressio vacui ad -10°C, 0.350 Torr per primas duas horas, et ad 0°C et 0.120 Torr per reliquas 22 horas ex 24 horis constitutae sunt ut nanoparticulae insulinae siccae obtinerentur.
Ad insulinum incapsulatum generandum, Buchi Mini Pulverisatio Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Helvetia) adhibita est. Parametri exsiccationis selecti fuerunt: temperatura 100°C, fluxus alimentationis 3 L/min, et fluxus gasis 4 L/min.
Nanoparticulae insulini ante et post dehydrationem per spectroscopiam FTIR-ATR descriptae sunt. Nanoparticulae dehydratae necnon insulinum liberum et chitosanum per spectrophotometrum FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) instructum accessorio universali ad exemplificationem ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) analysatae sunt. Mediae signorum ex 16 scansionibus cum resolutione 4 cm² in ambitu frequentiae 4000-600 cm² obtentae sunt.
Morphologia nanoparticulorum insulini siccarum per imagines microscopiae electronicae electronicae (SEM) nanoparticulorum insulini congelationis-siccatarum et pulverizationis-siccatarum aestimata est, quas Microscopium Electronicum Perlustrans Fasciculum Ionum Focusatum Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) captavit. Parametrus principalis adhibitus erat tensio 5 keV et fluxus electricus 30 mA.
Omnes nanoparticulae insulinae dehydratae in aqua dehydrata iterum dissolutae sunt. Magnitudo particularum, PDI, EE et LC iterum probatae sunt, eadem methodo antea dicta, ad qualitatem earum post dehydrationem aestimandam. Stabilitas nanoparticulorum anhydroinsulinae etiam mensurata est per proprietates nanoparticulorum post diuturnam conservationem. In hoc studio, omnes nanoparticulae post dehydrationem in armario frigidario per tres menses conservatae sunt. Post tres menses conservationis, nanoparticulae pro magnitudine morphologica particularum, PDI, EE et LC probatae sunt.
Ad efficaciam insulini in protegendis nanoparticulis post dehydrationem aestimandam, 5 mL nanoparticulorum reconstitutorum in 45 mL cum liquido gastrico simulato (pH 1.2, pepsinum 1%), liquido intestinali (pH 6.8, trypsinum 1%), vel solutione chymotrypsini (100 g/mL, in solutione tamponata phosphatis, pH 7.8) dissolvere oportet. Hae nanoparticulae ad 37°C cum celeritate agitationis 100 rpm incubatae sunt. 500 μL solutionis diversis temporibus collectae sunt et concentratio insulini per HPLC determinata est.
Modus emissionis *in vitro* nanoparticulorum insulinae recens praeparatarum et dehydratarum per methodum sacci dialysis (limine ponderis molecularis 100 kDa, Spectra Por Inc.) examinatus est. Nanoparticulae siccae recens praeparatae et reconstitutae in fluidis pH 2.5, pH 6.6, et pH 7.0 (0.1 M solutione salina phosphato tamponata, PBS) dialysatae sunt ad simulandum ambitum pH stomachi, duodeni, et intestini tenuis superioris, respective. Omnia exempla incubata sunt ad 37°C cum agitatione continua ad 200 rpm. Fluidum extra sacculum dialysis 5 mL his temporibus aspira: 0.5, 1, 2, 3, 4, et 6 h, et statim volumen dialysato recenti reple. Contaminatio insulinae in fluido per HPLC analysata est, et ratio emissionis insulinae ex nanoparticulis ex ratione insulinae liberae emissae ad insulinam totalem in nanoparticulis inclusam calculata est (Aequatio 3).
Cellulae carcinomatis hepatocellularis humani HepG2 in patellis 60 mm diametro cultae sunt, utens Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) continente 10% serorum bovinorum fetalium, 100 IU/mL penicillini, et 100 μg/mL streptomycini29. Culturae ad 37°C, 95% humiditatem relativam, et 5% CO2 conservatae sunt. Ad probationes absorptionis, cellulae HepG2 in systemate laminarum cameralium Nunc Lab-Tek 8-putorum (Thermo Fisher, NY, USA) 1 × 10⁴ cellularum/ml seminatae sunt. Ad probationes cytotoxicitatis, in laminas 96-putorum (Corning, NY, USA) densitate 5 × 10⁴ cellularum/ml seminatae sunt.
Experimentum MTT adhibitum est ad cytotoxicitatem nanoparticulorum insulini recens praeparatarum et dehydratarum aestimandam. Cellulae HepG2 in laminis 96 puteorum densitate 5 × 10⁴ cellularum/mL seminatae et per 7 dies ante probationem cultae sunt. Nanoparticulae insulini ad varias concentrationes (50 ad 500 μg/mL) in medio culturae dilutae et deinde cellulis administratae sunt. Post 24 horas incubationis, cellulae ter cum PBS lavatae et cum medio continente 0.5 mg/ml MTT per 4 horas amplius incubatae sunt. Cytotoxicitas aestimata est mensurando reductionem enzymaticam tetrazolii flavi MTT ad formazanum purpureum ad 570 nm utens lectore laminarum spectrophotometrico Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Helvetia).
Efficientia absorptionis cellularis nanoparticulorum (NP) per microscopiam laseris confocalem et analysin cytometriae fluxus probata est. Quaeque puteula systematis laminarum camerarum Nunc Lab-Tek cum insulina FITC libera, NP insulina FITC onusta, tractata est, et 25 μg/mL NP insulinae FITC dehydratae eadem concentratione reconstituta est et per 4 horas incubata. Cellulae ter cum PBS lavatae et cum 4% paraformaldehydo fixae sunt. Nuclei cum 4′,6-diamidino-2-phenylindolo (DAPI) tincti sunt. Localizatio insulinae observata est utens microscopio confocali laseris Olympus FV1000/duorum photonorum (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Iaponia). Ad analysin cytometriae fluxus, eaedem concentrationes 10 μg/mL insulinae FITC liberae, NP insulina FITC onustae, et NP insulinae FITC dehydratae resolubilisatae additae sunt. Laminae 96 puteorum cellulis HepG2 seminatae et per quattuor horas incubatae sunt. Post quattuor horas incubationis, cellulae remotae et ter FBS lavatae sunt. Quinque × 10⁴ cellulae per specimen cytometro fluxus BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nova Caesarea, Civitates Foederatae Americae) analysatae sunt.
Omnes valores exprimuntur ut media ± deviatio standardis. Comparationes inter omnes greges aestimatae sunt utens ANOVA unidirectionali vel probatione t a IBM SPSS Statistics 26 pro Mac (IBM, Endicott, Novum Eboracum, USA) et p < 0.05 statistica significatione habitum est.
Hoc studium flexibilitatem et facultatem exsiccationis per pulverizationem ad dehydratandas nanoparticulas chitosani/TPP/insulinae reticulatas cum meliore reconstitutione comparata cum methodis exsiccationis per congelationem usitatis, quae agentes amplificantes vel cryoprotectores utuntur, demonstrat. Nanoparticulae insulinae optimizatae magnitudinem particularum mediam 318 nm et efficientiam encapsulationis 99.4% protulerunt. Resultata SEM et FTIR post dehydrationem demonstraverunt structuram sphaericam tantum in nanoparticulis exsiccatis per pulverizationem cum et sine mannitolo et lyophilizatis cum mannitolo conservatam esse, sed nanoparticulae lyophilizatae sine mannitolo per dehydrationem decompositae sunt. In probatione facultatis reconstitutionis, nanoparticulae insulinae exsiccatae per pulverizationem sine mannitolo minimam magnitudinem particularum mediam et maximum onus post reconstitutionem ostenderunt. Modi liberationis omnium harum nanoparticularum dehydratarum demonstraverunt eas celeriter liberari in solutionibus pH = 2.5 et pH = 7, et valde stabiles esse in solutione pH = 6.5. Comparatae cum aliis nanoparticulis dehydratis redissolutis, nanoparticulae... Siccatio per pulverizationem sine mannitolo celerrimam liberationem ostendit. Hoc resultat congruit cum eo quod in experimento absorptionis cellularis observatum est, cum nanoparticulae per pulverizationem exsiccatae, mannitolo absente, fere omnino efficientiam absorptionis cellularis nanoparticularum recens praeparatarum servaverint. Haec resultata suggerunt nanoparticulas insulini siccas, per siccationem per pulverizationem sine mannitolo praeparatas, aptissimas esse ad ulteriorem processum in alias formas medicamentorum anhydricas, ut tabulas orales vel pelliculas bioadhaerentes.
Ob problemata proprietatis intellectualis, notitiarum congeries per hoc studium generatae et/vel analysatae publice non praesto sunt, sed ab auctoribus respectivis si rationabilem petitionem faciunt praesto sunt.
Kagan, A. Diabetes mellitus typi 2: origines sociales et scientificae, complicationes medicae, et implicationes pro aegrotis aliisque. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. et Jiang, P. Progressus incapsulationis insulini: num administratio oralis nunc possibilis est? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR. Progressus recentes in systematibus liposomatum insulinico onustorum oralibus ad diabetam curandam. Interpretatio. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).