Articulus est pars argumenti investigationis "Resistentiam leguminum ad pathogena et pestes augendam", vide omnes 5 articulos.
Agens necrosis morbi fungalis plantarum *Sclerotinia sclerotiorum* (Lib.) de Bary, strategia multiplici gradu utitur ad plantas hospites varias inficiendas. Hoc studium usum diamini L-ornithini, aminoacidi non-proteinici quod synthesis aliorum aminoacidorum essentialium stimulat, proponit ut strategiam alternativam administrationis ad responsa molecularia, physiologica et biochemica Phaseoli vulgaris L. ad mucorem album a *Pseudomonas sclerotiorum* causatum augendos. Experimenta *in vitro* demonstraverunt L-ornithinum significanter incrementum myceliacum *S. pyrenoidosae* modo dosi dependente inhibuisse. Praeterea, gravitatem mucoris albi sub condicionibus tepidarii significanter reducere potuit. Insuper, L-ornithinum incrementum plantarum tractatarum stimulavit, indicando concentrationes probatas L-ornithini non fuisse phytotoxicas plantis tractatis. Praeterea, L-ornithinum expressionem antioxidantium non-enzymaticorum (phenolicorum et flavonoidorum solubilium totalium) et antioxidantium enzymaticorum (catalasis (CAT), peroxidasis (POX), et polyphenol oxidasis (PPO)) auxit, et expressionem trium genorum antioxidantibus conexorum (PvCAT1, PvSOD, et PvGR) auxit. Insuper, analysis in silico praesentiam putativae oxaloacetatis acetylhydrolasis (SsOAH) in genoma S. sclerotiorum revelavit, quae proteinis oxaloacetatis acetylhydrolasis (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) et Penicillii sp. (PlOAH) valde similis erat secundum analysin functionalem, dominia conservata, et topologiam. Curiose, additio L-ornithini ad medium iusculi dextrosi solani (PDB) expressionem geni SsOAH in mycelis S. sclerotiorum significanter diminuit. Similiter, applicatio exogena L-ornithini expressionem geni SsOAH in mycelis fungalibus collectis ex plantis tractatis significanter minuit. Denique, applicatio L-ornithini secretionem acidi oxalici et in medio PDB et in foliis infectis significanter minuit. In conclusione, L-ornithinum partes primas agit in statu redox conservando necnon in responsione defensiva plantarum infectarum amplificanda. Resultata huius studii in excogitandis methodis novis et ecologicis ad mucorem album moderandum et eius impulsum in productionem fabarum et alias segetes mitigandum iuvare possunt.
Mucor albus, a fungo necrotrophico *Sclerotinia sclerotiorum* (Lib.) de Bary causatus, est morbus vastans, proventum minuens, qui gravem minam productioni globali fabae (Phaseoli vulgaris L.) infert (Bolton et al., 2006). *Sclerotinia sclerotiorum* est unus e difficillimis pathogenis fungalibus plantarum in solo ortis ad moderandum, cum lata gamma hospitum plus quam 600 specierum plantarum et facultate celeriter macerandi tela hospitum modo non specifico (Liang et Rollins, 2018). Sub condicionibus adversis, phasem criticam cycli sui vitae subit, diu dormiens manens ut structurae nigrae, durae, seminum similes, 'sclerotia' appellatae in solo, vel ut excrescentiae albae, molles in mycelio vel medulla caulis plantarum infectarum (Schwartz et al., 2005). *S. sclerotiorum* sclerotia formandi capax est, quod ei permittit in agris infectis diu superesse et per morbum persistere (Schwartz et al., 2005). Sclerotia nutrimentis abundant, in solo diu permanere possunt, et ut inoculum primarium pro infectionibus subsequentibus funguntur (Schwartz et al., 2005). Sub condicionibus faventibus, sclerotia germinant et sporas aereas producunt quae omnes partes plantae supra terram inficere possunt, inter quas flores, caules, vel siliquas (Schwartz et al., 2005).
*Sclerotinia sclerotiorum* strategiam multiplicem ad plantas hospites inficiendas adhibet, seriem eventuum coordinatorum a germinatione sclerotiali ad evolutionem symptomatum implicans. Initio, *Sclerotinia sclerotiorum* sporas suspensas (ascosporas appellatas) ex structuris fungo similibus, apotheciis appellatis, producit, quae in aere volant et in sclerotia immotilia in reliquiis plantarum infectarum evolvuntur (Bolton et al., 2006). Deinde fungus acidum oxalicum, factorem virulentiae, secernit ad pH parietis cellularis plantae moderandum, degradationem enzymaticam et invasionem textuum promovendam (Hegedus et Rimmer, 2005), et eruptionem oxidativam plantae hospitis reprimendam. Hic processus acidificationis parietem cellularem plantae debilitat, ambitum favorabilem pro operatione normali et efficaci enzymorum degradantium parietem cellularem fungorum (CWDEs) praebens, permittens pathogeno ut impedimentum physicum superet et textus hospitis penetret (Marciano et al., 1983). Postquam penetratum est, *S. sclerotiorum* plura enzyma bacterialia cum pathogenis (CWDE), ut polygalacturonasem et cellulasem, secernit, quae eius disseminationem in textibus infectis faciliorem reddunt et necrosis textuum efficiunt. Progressus laesionum et stratorum hyphalorum ad symptomata propria fungorum alborum ducit (Hegedus et Rimmer, 2005). Interea, plantae hospites exemplaria molecularia pathogenis associata (PAMPs) per receptores recognitionis exemplarium (PRRs) agnoscunt, seriem eventuum signalationis incitantes quae tandem responsa defensiva excitant.
Quamquam per decennia conatus ad morbos coercendos fiunt, inopia germinis resistentis sufficiens in faba, sicut in aliis culturis commercialibus, manet, propter resistentiam, superviventiam, et adaptabilitatem pathogeni. Curatio morborum igitur difficillima est et requirit strategiam integratam et multiplex quae combinationem exercitationum culturalium, coercitionis biologicae, et fungicidarum chemicarum includit (O'Sullivan et al., 2021). Coercitio chemica mucoris albi est efficacissima quia fungicidae, cum recte et tempore opportuno adhibentur, propagationem morbi efficaciter coercere, gravitatem infectionis minuere, et damna proventus minimizare possunt. Tamen, usus immodicus et fiducia nimia in fungicidas potest ad emergentiam stirpium resistentium S. sclerotiorum ducere et negative organismos non destinatos, salutem soli, et qualitatem aquae afficere (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ergo, invenire alternativas ecologicas summa prioritas facta est.
Polyaminae (PA), ut putrescinum, spermidinum, sperminum, et cadaverinum, alternativas promittentes contra pathogena plantarum e solo orta esse possunt, ita usum fungicidarum chemicorum periculosorum vel omnino vel partim reducendo (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). In plantis superioribus, PA in multis processibus physiologicis implicantur, inter quas, sed non solum, divisio cellularum, differentiatio, et responsio ad accentus abioticos et bioticos (Killiny et Nehela, 2020). Antioxidantia fungi possunt, species oxygenii reactivas (ROS) removere, homeostasis redox conservare (Nehela et Killiny, 2023), gena defensionis conexa inducere (Romero et al., 2018), varias vias metabolicas moderari (Nehela et Killiny, 2023), phytohormonas endogenas moderari (Nehela et Killiny, 2019), resistentiam systemicam acquisitam (SAR) stabilire, et interactiones plantarum et pathogenorum moderari (Nehela et Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Notandum est mechanismos specificos et munera acidorum oxygenii (PA) in defensione plantarum variare secundum species plantarum, pathogena, et condiciones ambientales. Abundantissima PA in plantis ex polyamino essentiali L-ornithino biosynthesizata est (Killiny et Nehela, 2020).
L-ornithinum multiplices partes in incremento et evolutione plantarum agit. Exempli gratia, studia priora demonstraverunt in oryza (Oryza sativa) ornithinum cum nitrogenii recirculatione (Liu et al., 2018), proventu, qualitate et aroma oryzae (Lu et al., 2020), et responsione ad stress aquae (Yang et al., 2000) coniunctum esse posse. Praeterea, applicatio exogena L-ornithini tolerantiam siccitatis in beta saccharifera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) significanter auxit et stress salis in cepa (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu et Çavuşoǧlu, 2021) et plantis anacardii (Anacardium occidentale) lenivit (da Rocha et al., 2012). Munus potentiale L-ornithini in defensione contra stress abioticum fortasse ex eius implicatione in accumulatione prolini in plantis tractatis oritur. Exempli gratia, gena ad metabolismum prolini pertinentia, ut ornithini delta aminotransferasis (delta-OAT) et prolini dehydrogenasis (ProDH1 et ProDH2), antea relata sunt implicata esse in defensione Nicotianae benthamianae et Arabidopsis thalianae contra stirpes Pseudomonas syringae non hospites (Senthil-Kumar et Mysore, 2012). Ex altera parte, ornithini decarboxylase fungalis (ODC) requiritur ad incrementum pathogenorum (Singh et al., 2020). Dirigendo ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici per silentium genicum ab hospite inductum (HIGS) resistentiam plantarum lycopersici contra Fusarium wilt significanter auxit (Singh et al., 2020). Tamen, munus potentiale applicationis ornithini exogeni contra stresses bioticos ut phytopathogena nondum bene investigatum est. Magis autem interest quod effectus ornithini in resistentiam morborum et phaenomena biochemica et physiologica conexa plerumque inexplorata manent.
Intellectus complexitatis infectionis *S. sclerotiorum* in leguminibus magni momenti est ad evolvendas efficaces strategias coercendi. In hoc studio, propositum nostrum erat munus potentiale diamini L-ornithini ut factorem clavem in augendis mechanismis defensionis et resistentia plantarum leguminum contra infectionem *Sclerotinia sclerotiorum* explorare. Hypothesim ponimus L-ornithinum, praeter augendas responsa defensiva plantarum infectarum, etiam munus clavem agere in conservando statu redox. Proponimus effectus potentiales L-ornithini coniungi cum regulatione mechanismorum defensionis antioxidantium enzymaticorum et non-enzymaticorum et interferentia cum factoribus pathogenicitatis/virulentiae fungalis et proteinis associatis. Haec duplex functionalitas L-ornithini facit ut candidatum promittat pro strategia sustinabili ad mitigandum impulsum mucoris albi et augendam resistentiam plantarum leguminum communium contra hunc potentem pathogenum fungalem. Resultata praesentis studii adiuvare possunt in evolutione methodorum innovativarum, ecologicarum ad coercendum mucorem album et mitigandum eius impulsum in productionem leguminum.
In hoc studio, varietas commercialis fabae communis, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), susceptibilis, ut materia experimentalis adhibita est. Semina sana benigne donata sunt a Departamento Investigationis Leguminum, Instituto Investigationis Segetum Campestrium (FCRI), Centro Investigationis Agriculturae (ARC), Aegypto. Quinque semina in vasis plasticis (diametro interno 35 cm, profundo 50 cm) repletis solo a S. sclerotiorum infecta sub condicionibus tepidarii (25 ± 2 °C, humiditate relativa 75 ± 1%, 8 h lucis/16 h tenebrarum) sata sunt. Post 7-10 dies a seminatione (DPS), plantulae extenuatae sunt ut tantum duae plantulae cum incremento uniformi et tribus foliis plene expansis in quoque vase remanerent. Omnes plantae in vasis positae semel per duas hebdomades rigabantur et menstruatim stercorabantur ad rationem commendatam pro varietate data.
Ad L-ornithinediamini (etiam acidum (+)-(S)-2,5-diaminopentanoicum appellatum; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) concentrationem 500 mg/L praeparandam, primum 50 mg in 100 mL aquae destillatae sterilis dissoluti sunt. Solutio principalis deinde diluta et in experimentis subsequentibus adhibita est. Breviter, sex series concentrationum L-ornithini (12.5, 25, 50, 75, 100, et 125 mg/L) in vitro probatae sunt. Praeterea, aqua destillata sterilis ut exemplar negativum (Mock) et fungicida commercialis "Rizolex-T" pulvis humectabilis 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Aegyptus) ut exemplar positivum adhibitus est. Fungicida commercialis "Rizolex-T" in vitro quinque concentrationibus (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L) probatum est.
Exempla caulium et siliquarum phaseolorum communium, symptomata typica mucoris albi (infestationis proportio: 10-30%) ostendentium, ex agris commercialibus collecta sunt. Quamquam pleraeque materiae plantarum infectae secundum speciem/varietatem (varietas commercialis susceptibilis Giza 3) identificatae sunt, aliae, praesertim eae quae ex mercatibus localibus obtentae sunt, speciei ignotae erant. Materiae infectae collectae primum superficie cum solutione hypochloriti natrii 0.5% per 3 minuta disinfectae sunt, deinde pluries aqua sterili distillata ablutae et charta sterili filtratoria siccae ad superfluam aquam removendam. Organa infecta deinde in frusta parva ex textu medio (inter textus sanos et infectos) secta sunt, in medio agaro cum dextroso solani (PDA) culta et ad 25 ± 2°C cum cyclo 12 horarum lucis/12 horarum obscuritatis per 5 dies incubata sunt ad formationem sclerotiorum stimulandam. Methodus apicis mycelii etiam adhibita est ad isolata fungalia ex culturis mixtis vel contaminatis purificanda. Isolatum fungale purificatum primum secundum notas morphologicas culturales identificatum est et deinde secundum notas microscopicas confirmatum est esse S. sclerotiorum. Denique, omnia isolata purificata in cultivari fabae communis Giza 3, quae susceptibilis est, ad pathogenitatem examinata sunt ut postulatis Kochianis satisfacerent.
Praeterea, isolatum S. sclerotiorum maxime invasivum (isolatum #3) ulterius confirmatum est secundum sequentiationem internum transcriptam (ITS) sicut descriptum est a White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Breviter, isolata in liquore dextroso solani (PDB) culta et incubata sunt ad 25 ± 2°C per 5-7 dies. Mycelium fungale deinde collectum, per caseum filtratum, bis aqua sterili lotum, et charta sterili filtratoria siccatum est. DNA genomicum isolatum est utens Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Regio ITS rDNA deinde amplificata est utens pari primerorum specifico ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; magnitudo exspectata: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Producta PCR purificata ad sequentiationem missa sunt (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sequentiae ITS rDNA bidirectionaliter sequentiatae sunt utens methodo sequentiationis Sanger. Sequentiae interrogationis collectae deinde comparatae sunt cum recentissimis datis in GenBank et Centro Nationali Informationis Biotechnologicae (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utens programmate BLASTn. Sequentia interrogationis comparata est cum 20 aliis stirpibus/isolatis S. sclerotiorum recuperatis ex recentissimis datis in NCBI GenBank (Tabula Supplementaria S1) utens ClustalW in Fasciculo Analysis Geneticae Evolutionis Molecularis (MEGA-11; versio 11) (Kumar et al., 2024). Analysis evolutionaria peracta est utens methodo maximae verisimilitudinis et modello generali substitutionis nucleotidorum tempore reversibili (Nei et Kumar, 2000). Arbor cum maxima log-verosimilitudine ostenditur. Arbor initialis pro investigatione heuristica selectus est eligendo arborem cum maiori log-verosimilitudine inter arborem neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) et arborem maximae parsimoniae (MP). Arbor NJ constructa est utens matrice distantiae binariae computatae utens modello generali tempore reversibili (Nei et Kumar, 2000).
Actio antibacterialis L-ornithini et bactericidae "Rizolex-T" in vitro per methodum diffusionis agar determinata est. Methodus: Sumitur quantitas apta solutionis stock L-ornithini (500 mg/L) et diligenter miscetur cum 10 ml medii nutrientis PDA ad praeparandas solutiones cum concentrationibus finalibus 12.5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L, respective. Quinque concentrationes fungicidae "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L) et aqua destillata sterilis ut exemplar testium adhibitae sunt. Postquam medium solidificatum est, obturamentum mycelialem culturae Sclerotinia sclerotiorum recens paratum, 4 mm diametro, in centrum patinae Petri translatum et ad 25±2°C cultum est donec mycelium totam patinam Petri testium tegeret, post quod incrementum fungali notatum est. Calcula inhibitionem percentualem accretionis radialis S. sclerotiorum utens aequatione 1:
Experimentum bis repetitum est, cum sex replicationibus biologicis pro quolibet grege testigo/experimentali et quinque vasis (duabus plantis per vas) pro quolibet replicatione biologica. Quodque replicatio biologica bis analysata est (duabus replicationibus technicis) ut accuratio, fides et reproducibilitas eventuum experimentalium confirmarentur. Praeterea, analysis regressionis probit adhibita est ad concentrationem inhibitoriam semi-maximalem (IC50) et IC99 calculandas (Prentice, 1976).
Ad potentiam L-ornithini sub condicionibus tepidarii aestimandam, duo experimenta in vasis continua peracta sunt. Breviter, vasa terra argilloso-arenosa sterili (3:1) impleta sunt et cultura S. sclerotiorum recens praeparata inoculata sunt. Primo, isolatum S. sclerotiorum maxime invasivum (isolatum #3) cultum est uno sclerotio in duas partes secato, prono in PDA posito et ad 25°C in tenebris constantibus (24 horas) per 4 dies incubato ad incrementum mycelii stimulandum. Deinde quattuor obturamenta agar 5 mm diametro ex margine anteriore sumpta sunt et cum 100 g mixturae sterilis tritici et furfuris oryzae (1:1, v/v) inoculata sunt et omnes ampullae ad 25 ± 2°C sub cyclo 12 horarum lucis/12 horarum obscuritatis per 5 dies incubatae sunt ad formationem sclerotiorum stimulandam. Contenta omnium ampullarum diligenter mixta sunt ad homogeniam curandam antequam terra adderetur. Deinde, centum grammata mixturae furfuris colonizantis in singula olla addita sunt ut constans pathogenorum concentratio conservaretur. Ollae inoculatae rigatae sunt ut incrementum fungorum excitaretur et in tepidario per septem dies collocatae sunt.
Deinde quinque semina varietatis Giza 3 in singulis vasis sata sunt. In vasis L-ornithino et fungicida Rizolex-T tractatis, semina sterilizata primum per duas horas in solutione aquosa duorum compositorum macerata sunt, cum concentratione IC99 finali circiter 250 mg/L et 50 mg/L respective, deinde per unam horam aere siccantur ante seminationem. Contra, semina in aqua sterili destillata, ut testis negativus, macerata sunt. Post decem dies, ante primam irrigationem, plantulae extenuatae sunt, tantum duae plantulae purae in singulis vasis relictae. Praeterea, ad infectionem cum S. sclerotiorum confirmandam, caules plantarum fabae in eodem stadio evolutionis (10 dies) in duobus locis diversis scalpello sterilizato secati sunt, et circiter 0.5 g mixturae furfuris colonizantis in singulas vulnus immissa sunt, deinde alta humiditas ad infectionem et progressionem morbi in omnibus plantis inoculatis stimulandas adhibita est. Plantae comparationis similiter vulneratae sunt et aequalis quantitas (0.5 g) mixturae furfuris sterilis, non colonizatae, in vulnus immissa est et sub alta humiditate conservata, ut ambitus pro evolutione morbi simularetur et constantia inter greges curationis conservaretur.
Modus curationis: Plantae phaseoli rigabantur solo cum 500 ml solutionis aquosae L-ornithini (250 mg/l) vel fungicidae Rizolex-T (50 mg/l), deinde curatio ter repetita est intervallo decem dierum. Pars placebo tractata, 500 ml aquae destillatae sterilis irrigata est. Omnes curationes sub condicionibus tepidarii peractae sunt (25 ± 2°C, 75 ± 1% humiditas relativa, et photoperiodus 8 horarum lucis/16 horarum tenebrarum). Omnia vasa bis in mense rigabantur et menstruatim stercore NPK aequilibrato (20-20-20, cum 3.6% sulphuris et microelementis TE; Zain Seeds, Aegyptus) concentratione 3-4 g/l per aspersionem foliarem, secundum commendationes varietatis specificae et instructiones fabricatoris, tractabantur. Nisi aliter dictum est, folia maturissima plene expansa (secunda et tertia folia a summo) ex unoquoque exemplari biologico post 72 horas post curationem (hpt) collecta, homogeneizata, in unum congregata, et ad -80°C conservata sunt ad ulteriores analyses, inter quas, sed non limitatas ad, localizationem histochemicam in situ indicatorum tensionis oxidativae, peroxidationem lipidorum, antioxidantia enzymatica et non-enzymatica, et expressionem genorum.
Intensitas infectionis mucoris albi (dpi) hebdomadaliter post inoculationem 21 dies aestimata est, scala 1-9 (Tabula Suppletoria S2) secundum scalam Petzoldt et Dickson (1996) a Teran et al. (2006) modificatam. Breviter, caules et rami plantarum fabae examinati sunt, a puncto inoculationis incipientes, ut progressionem laesionum per internodia et nodos sequeretur. Deinde distantia laesionis a puncto inoculationis ad punctum remotissimum per caulem vel ramum mensurata est, et nota 1-9 secundum locum laesionis assignata est, ubi (1) nullam infectionem visibilem prope punctum inoculationis indicabat, et (2-9) augmentum gradatim magnitudinis laesionis et progressionis per nodos/internodia indicabat (Tabula Suppletoria S2). Intensitas infectionis mucoris albi deinde in percentagem conversa est, formula 2 utens:
Praeterea, area sub curva progressionis morbi (AUDPC) calculata est utens formula (Shaner et Finney, 1977), quae nuper adaptata est ad putredinem albam fabae communis (Chauhan et al., 2020) utens aequatione 3:
Ubi Yi = gravitas morbi tempore ti, Yi+1 = gravitas morbi tempore proximo ti+1, ti = tempus primae mensurae (in diebus), ti+1 = tempus proximae mensurae (in diebus), n = numerus totalis punctorum temporalium vel punctorum observationis. Parametri accretionis plantae phaseoli, inter quos altitudo plantae (cm), numerus ramorum per plantam, et numerus foliorum per plantam, hebdomadaliter per 21 dies in omnibus replicationibus biologicis notati sunt.
In unaquaque replicatione biologica, exempla foliorum (secunda et tertia folia plene evoluta a summo) die quadragesimo quinto post curationem (quindecim diebus post ultimam curationem) collecta sunt. Unaquaeque replicatio biologica quinque vasis constabat (duabus plantis per vas). Circa quingentas mg textus contusi ad extractionem pigmentorum photosyntheticorum (chlorophylli a, chlorophylli b et carotenoidum) ad 80% acetone ad 4°C in tenebris adhibita est. Post viginti quattuor horas, exempla centrifugata sunt et supernatans collectum est ad determinationem contentorum chlorophylli a, chlorophylli b et carotenoidum colorimetrice utens spectrophotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Iaponia) secundum methodum (Lichtenthaler, 1987) mensurando absorptionem ad tres diversas longitudines undarum (A470, A646 et A663 nm). Denique, contentum pigmentorum photosyntheticorum calculatum est utens formulis sequentibus 4-6 a Lichtenthaler (1987) descriptis.
Post horas septuaginta duas post curationem (hpt), folia (secunda et tertia folia plene evoluta a summo) ex unoquoque exemplari biologico collecta sunt ad in situ localizationem histochemicam hydrogenii peroxidi (H2O2) et anionis superoxidi (O2•−). Quodque exemplar biologicum quinque vasis constabat (duabus plantis per vas). Quodque exemplar biologicum in duplicato (duobus exemplaribus technicis) analysatum est ad accuratiam, fidem et reproducibilitatem methodi confirmandam. H2O2 et O2•− determinatae sunt utens 0.1% 3,3′-diaminobenzidino (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) vel nitrocaeruleo tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), respective, methodos a Romero-Puertas et al. (2004) et Adam et al. (1989) descriptas cum modificationibus minoribus sequentes. Ad localizationem histochemicam H2O2 in situ, foliolae vacuo filtratae sunt cum 0.1% DAB in 10 mM Tris solutione tamponata (pH 7.8) et deinde ad temperaturam ambientem in luce per 60 minuta incubatae. Foliolae dealbatae sunt in 0.15% (v/v) TCA in 4:1 (v/v) ethanol:chloroformium (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Aegyptus) et deinde luci expositae donec obscurarentur. Similiter, valvulae vacuo filtratae sunt cum 10 mM kalium phosphate solutione tamponata (pH 7.8) continenti 0.1 w/v % HBT ad localizationem histochemicam O2•− in situ. Foliolae in luce ad temperaturam ambientem per 20 minuta incubatae sunt, deinde ut supra dealbatae, et deinde illuminatae donec maculae caeruleae/violaceae obscurae apparuerunt. Intensitas coloris fusci (ut indicem H₂O₂) vel caeruleo-violacei (ut indicem O₂•−) resultantis aestimata est per versionem Vijianam programmatis ad imagines tractandas ImageJ (http://fiji.sc; accessum VII Martii MMXXIV).
Malondialdehydum (MDA; ut signum peroxidationis lipidorum) secundum methodum Du et Bramlage (1992) cum levibus modificationibus determinatum est. Folia ex unoquoque exemplari biologico (secundo et tertio foliis plene evolutis a summo) collecta sunt 72 horis post curationem (hpt). Unumquodque exemplar biologicum quinque vasa continebat (duas plantas per vas). Unumquodque exemplar biologicum in duplicato (duobus exemplaribus technicis) analysatum est ut accuratio, fides et reproducibilitas methodi confirmarentur. Breviter, 0.5 g textus folii triti ad extractionem MDA cum 20% acido trichloroacetico (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) continente 0.01% butylatum hydroxytoluenum (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) adhibitum est. Quantitas MDA in supernatante deinde colorimetrice determinata est absorptionem ad 532 et 600 nm spectrophotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Iaponia) mensurando, et deinde ut nmol g−1 FW expressa.
Ad aestimationem antioxidantium non-enzymaticorum et enzymaticorum, folia (secunda et tertia folia plene evoluta a summo) ex unoquoque exemplari biologico post 72 horas post curationem (hpt) collecta sunt. Quodque exemplar biologicum ex quinque vasis constabat (duabus plantis per vas). Quodque exemplum biologicum dupliciter analysatum est (duo exempla technica). Duo folia nitrogenio liquido trita sunt et directe ad determinationem antioxidantium enzymaticorum et non-enzymaticorum, aminoacidorum totalium, contenti prolini, expressionis genorum, et quantificationis oxalatis adhibita sunt.
Phenolica totalia solubilia determinata sunt utens reagente Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) cum levibus modificationibus methodi descriptae a Kahkonen et al. (1999). Breviter, circiter 0.1 g textus folii homogeneizati extractum est cum 20 ml methanoli 80% in tenebris per 24 horas et supernatans collectum est post centrifugationem. 0.1 ml extracti exempli mixtum est cum 0.5 ml reagenti Folin-Ciocalteu (10%), agitatum per 30 secundas et relictum in tenebris per 5 minuta. Deinde 0.5 ml solutionis carbonatis natrii 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) additum est in singulos tubos, diligenter mixtum et incubatum temperatura ambiente in tenebris per 1 horam. Post incubationem, absorptio mixtionis reactionis ad longitudinem undarum 765 nm mensurata est utens spectrophotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Iaponia). Concentratio phenolum totalium solubilium in extractis exemplaribus determinata est utens curva calibrationis acidi gallici (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) et expressa est ut milligrammata aequivalentis acidi gallici per gramma ponderis recentis (mg GAE g-1 ponderis recentis).
Flavonoidum solubilium summa contenta secundum methodum Djeridane et al. (2006) cum levibus modificationibus determinata est. Breviter, 0.3 ml extracti methanoli supradicti cum 0.3 ml solutionis aluminii chloridi 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA mixta sunt, fortiter agitata, deinde ad temperaturam ambientem per 5 min incubata, deinde addita 0.3 ml solutionis kalii acetatis 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), diligenter mixta, et ad temperaturam ambientem per 30 min in tenebris incubata. Post incubationem, absorptio mixturae reactionis ad 430 nm spectrophotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Iaponia) mensurata est. Concentratio flavonoidum solubilium summarum in extractis exemplaribus determinata est curva calibrationis rutini (TCI America, Portland, OR, USA) et deinde expressa ut milligrammata aequivalentis rutini per gramma ponderis recentis (mg RE g-1 ponderis recentis).
Summa aminoacidorum liberorum in foliis fabae determinata est utens reagente ninhydrino modificato (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) secundum methodum a Yokoyama et Hiramatsu (2003) propositam et a Sun et al. (2006) modificatam. Breviter, 0.1 g textus triti extracta sunt cum solutione pH 5.4, et 200 μL supernatantis cum 200 μL ninhydrini (2%) et 200 μL pyridini (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) reacta sunt, in balneo aquae ferventis per 30 min incubata, deinde refrigerata et ad 580 nm mensurata spectrophotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Iaponia). Contra, prolina determinata est methodo Bates (Bates et al., 1973). Prolinum acido sulfosalicylico 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) extractum est, et post centrifugationem, 0.5 ml supernatantis cum 1 ml acidi acetici glacialis (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) et reagente ninhydrino mixtum est, ad 90°C per 45 min incubatum, refrigeratum et ad 520 nm eodem spectrophotometro quo supra mensuratum. Acida amino libera totalia et prolinum in extractis foliorum determinata sunt curvis calibrationis glycinae et prolinae (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) respective utens, et ut mg/g ponderis recentis expressa.
Ad actionem enzymaticam enzymorum antioxidantium determinandam, circiter 500 mg textus homogeneizati extracta sunt cum 3 ml solutionis Tris 50 mM (pH 7.8) continentis 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et 7.5% polyvinylpyrrolidoni (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugata ad 10,000 × g per 20 min sub refrigeratione (4°C), et supernatans (extractum enzymi crudum) collectum est (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Catalasa (CAT) deinde cum 2 ml solutionis phosphatis natrii 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et 100 μl solutionis H₂O₂ 269 mM reacta est ad eius actionem enzymaticam determinandam secundum methodum Aebi (1984) cum levibus modificationibus (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Actio enzymatica peroxidasae guaiacolo-dependentis (POX) determinata est methodo Harrach et al. (2009). (2008) cum modificationibus minoribus (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) et activitas enzymatica polyphenol oxidasis (PPO) determinata est post reactionem cum 2.2 ml solutionis phosphatis natrii 100 mM (pH 6.0), 100 μl guaiacoli (TCI chemicals, Portland, OR, USA) et 100 μl H2O2 12 mM. Methodus leviter modificata est ex (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Experimentum peractum est post reactionem cum 3 ml solutionis catecholi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) recens praeparatae in solutione phosphatis 0.1 M (pH 6.0). Actio CAT mensurata est per decompositionem H₂O₂ ad 240 nm (A240), actio POX mensurata est per augmentum absorptionis ad 436 nm (A436), et actio PPO mensurata est per fluctuationes absorptionis ad 495 nm (A495) singulis 30 s per 3 min notatas, utens spectrophotometro UV-160A (Shimadzu, Iaponia).
Adhibita est RT-PCR in tempore reali ad gradus transcriptionum trium genorum antioxidantibus conexorum detegendos, inter quos catalasis peroxisomalis (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxidi dismutasis (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), et glutathion reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), in foliis phaseoli (secunda et tertia folia plene evoluta a summo) 72 horis post ultimam curationem. Breviter, RNA isolata est utens Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) secundum protocollum fabricatoris. Deinde, cDNA synthesizata est utens TOP script™ cDNA Synthesis Kit secundum instructiones fabricatoris. Sequentiae primeriorum trium genorum supradictorum in Tabula Supplementi S3 enumerantur. PvActin-3 (numerus accessionis GenBank: XM_068616709.1) ut gen domesticum adhibitum est et relativa expressio geni per methodum 2-ΔΔCT calculata est (Livak et Schmittgen, 2001). Stabilitas actini sub stresse biotico (interactione incompatibili inter legumina communia et fungum anthracnosum Colletotrichum lindemuthianum) et stresse abiotico (siccitate, salinitate, temperatura humili) demonstrata est (Borges et al., 2012).
Initio analysin *in silico* proteinorum oxaloacetatis acetylhydrolasis (OAH) in *S. sclerotiorum* per totum genoma perfecimus, instrumento *protein-protein BLAST* (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) utentes. Breviter, OAH ex *Aspergillus fijiensis* CBS 313.89 (AfOAH; taxidum: 1191702; numerus accessionis GenBank XP_040799428.1; 342 aminoacida) et *Penicillium lagena* (PlOAH; taxidum: 94218; numerus accessionis GenBank XP_056833920.1; 316 aminoacida) ut sequentias interrogativas ad proteinum homologum in *S. sclerotiorum* (taxidum: 5180) mappandum usi sumus. Examen BLASTp peractum est contra recentissima data genomi S. sclerotiorum in GenBank, situs interretialis Centri Nationalis Informationis Biotechnologicae (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Praeterea, gen OAH praedictum ex *S. sclerotiorum* (SsOAH) et analysis evolutionaria atque arbor phylogenetica AfOAH ex *A. fijiensis* CBS 313.89 et PlOAH ex *P. lagena* deductae sunt utens methodo maximae verisimilitudinis in MEGA11 (Tamura et al., 2021) et modello JTT matrice fundato (Jones et al., 1992). Arbor phylogenetica cum analysi multiplici ordinationis sequentiarum proteinorum omnium genorum OAH praedictorum (SsOAH) ex *S. sclerotiorum* et sequentia interrogationis utens Instrumento Ordinationis Fundato in Coertionibus (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos et Agarwala, 2007) coniuncta est. Praeterea, sequentiae aminoacidorum SsOAH ex S. sclerotiorum optime congruentes cum sequentiis interrogationis (AfOAH et PlOAH) (Larkin et al., 2007) per ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ordinatae sunt, et regiones conservatae in ordinatione instrumento ESPript (versione 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) visualizatae sunt.
Praeterea, regiones repraesentativae functionales praedictae et loca conservata SsOAH S. sclerotiorum interactive in diversas familias classificata sunt instrumento InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Denique, simulatio structurae tridimensionalis (3D) SsOAH S. sclerotiorum praedictae peracta est instrumento Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) et per servitorem SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Structurae tridimensionales praedictae (formato PDB) interactive visualizatae sunt utens fasciculo UCSF-Chimera (versione 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR quantitativa fluorescentiae in tempore reali adhibita est ad gradum transcriptionalem oxaloacetatis acetylhydrolasis (SsOAH; numerus accessionis GenBank: XM_001590428.1) in mycelis Sclerotiniae sclerotiorum determinandum. Breviter, S. sclerotiorum in ampullam PDB continentem inoculatum est et in incubatore agitato (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ad 25 ± 2 °C per 24 horas ad 150 rpm et in tenebris constantibus (24 horas) collocatum est ad incrementum mycelii stimulandum. Deinde, cellulae cum L-ornithino et fungicida Rizolex-T ad concentrationes finales IC50 (circiter 40 et 3.2 mg/L, respective) tractatae sunt et deinde per alias 24 horas sub iisdem condicionibus cultae. Post incubationem, culturae ad 2500 rpm per 5 min centrifugatae sunt et supernatans (mycelium fungale) ad analysin expressionis genicae collectum est. Similiter, mycelium fungale post 0, 24, 48, 72, 96, et 120 horas post infectionem ex plantis infectis quae mucorem album et mycelium gossypinum in superficie textuum infectorum formaverant collectum est. RNA ex mycelio fungali extracta est et deinde cDNA synthesizata est ut supra descriptum est. Sequentiae primeriorum pro SsOAH in Tabula Supplementi S3 enumerantur. SsActin (numerus accessionis GenBank: XM_001589919.1) ut gen domesticum adhibitum est, et expressio genica relativa per methodum 2-ΔΔCT (Livak et Schmittgen, 2001) calculata est.
Acidum oxalicum in liquore dextroso ex solano (PDB) et exemplaribus plantarum pathogenum fungale Sclerotinia sclerotiorum continentibus secundum methodum Xu et Zhang (2000) cum levibus modificationibus determinatum est. Breviter, isolata S. sclerotiorum in ampullas PDB continentes inoculata sunt et deinde in incubatore agitato (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ad 150 rpm ad 25 ± 2 °C per 3-5 dies in tenebris constantibus (24 h) culta sunt ad incrementum mycelii stimulandum. Post incubationem, cultura fungalis primum per chartam filtratoriam Whatman #1 filtrata est et deinde ad 2500 rpm per 5 min centrifugata est ad mycelium residuum removendum. Supernatans collectum et ad 4°C conservatum est ad ulteriorem determinationem quantitativam oxalatis. Ad praeparationem exemplorum plantarum, circiter 0.1 g fragmentorum textus plantarum ter aqua destillata (2 ml singulis vicibus) extracta sunt. Exempla deinde ad 2500 rpm per quinque minuta centrifugata sunt, supernatans per chartam filtratoriam Whatman No. 1 sicco filtratum et ad ulteriorem analysin collectum est.
Ad quantitativam acidi oxalici analysin, mixtura reactionis in tubo vitreo obturato hoc ordine praeparata est: 0.2 ml exempli (vel filtrati culturae PDB vel solutionis normae acidi oxalici), 0.11 ml bromophenoli caerulei (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml 1 M acidi sulfurici (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) et 0.176 ml 100 mM kalium dichromatis (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), deinde solutio ad 4.8 ml aqua destillata diluta, vehementer mixta et statim in balneum aquae 60°C posita est. Post 10 min, reactio addita 0.5 ml solutionis natrii hydroxidi (NaOH; 0.75 M) interclusa est. Absorptio (A600) mixtionis reactionis ad longitudinem undae 600 nm mensurata est spectrophotometro UV-160 (Shimadzu Corporation, Iaponia). PDB et aqua destillata ut moderamina ad quantificationem filtratorum culturae et exemplorum plantarum, respective, adhibita sunt. Concentrationes acidi oxalici in filtratis culturae, expressae ut microgrammata acidi oxalici per millilitrum medii PDB (μg.mL−1), et in extractis foliorum, expressae ut microgrammata acidi oxalici per gramma ponderis recentis (μg.g−1 FW), determinatae sunt utens curva calibrationis acidi oxalici (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Per totum studium, omnia experimenta consilio omnino aleatorio (CRD) designata sunt, cum sex replicationibus biologicis per curationem et quinque vasis per replicationem biologicam (duabus plantis per vas), nisi aliter dictum est. Replicationes biologicae in duplicato (duabus replicationibus technicis) analysatae sunt. Replicationes technicae adhibitae sunt ad reproducibilitatem eiusdem experimenti comprobandam, sed in analysi statistica non adhibitae sunt ad replicationes spurias vitandas. Data statistice analysata sunt per analysin variantiae (ANOVA) deinde per probationem differentiae honestae significantis (HSD) Tukey-Kramer (p ≤ 0.05). Pro experimentis in vitro, valores IC50 et IC99 per exemplar probit computati sunt, et intervalla fiduciae 95% computata sunt.
In summa quattuor stirpes ex variis agris soiae in provincia El Ghabiya, Aegypto, collectae sunt. In medio PDA, omnia stirpes mycelium cremeo-album produxerunt, quod celeriter album gossypinum (Figura 1A) deinde fulvum vel fuscum in stadio sclerotii conversum est. Sclerotia plerumque densa, nigra, sphaerica vel irregularia sunt, 5.2 ad 7.7 mm longa et 3.4 ad 5.3 mm diametro (Figura 1B). Quamquam quattuor stirpes figuram marginalem sclerotiorum ad marginem medii culturae post 10-12 dies incubationis ad 25 ± 2 °C (Figura 1A) evolverunt, numerus sclerotiorum per laminam inter eas significanter differt (P < 0.001), stirpe 3 maximum numerum sclerotiorum habens (32.33 ± 1.53 sclerotia per laminam; Figura 1C). Similiter, isolatum #3 plus acidi oxalici in PDB quam alia isolata produxit (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolatum #3 notas morphologicas et microscopicas typicas fungi phytopathogenici Sclerotinia sclerotiorum ostendit. Exempli gratia, in PDA, coloniae isolati #3 celeriter creverunt, erant albae cremeolae (Figura 1A), inverse fulvae vel pallide flavo-brunneae, et 6-7 dies ad 25 ± 2°C requirebant ut superficiem laminae 9 cm diametri omnino tegerent. Fundamento in supradictis notis morphologicis et microscopicis, isolatum #3 ut Sclerotinia sclerotiorum identificatum est.
Figura 1. Characteres et pathogenicitas stirpium *S. sclerotiorum* ex communibus leguminum culturis. (A) Incrementum mycelii quattuor stirpium *S. sclerotiorum* in medio PDA, (B) sclerotia quattuor stirpium *S. sclerotiorum*, (C) numerus sclerotiorum (per laminam), (D) secretio acidi oxalici in medio PDB (μg.mL−1), et (E) gravitas morbi (%) quattuor stirpium *S. sclerotiorum* in cultivari leguminum commerciali susceptibili *Giza 3* sub condicionibus tepidarii. Valores mediam ± deviationem standardem quinque replicationum biologicarum repraesentant (n = 5). Litterae diversae differentias statistice significantes inter curationes indicant (p < 0.05). (F–H) Symptomata typica mucoris albi in caulibus et siliciis supra terram apparuerunt, respective, decem diebus post inoculationem cum stirpe #3 (dpi). (I) Analysis evolutionaria regionis internae transcriptae spacer (ITS) stirpis S. sclerotiorum tertiae methodo maximae verisimilitudinis peracta est et cum viginti stirpibus/stirpibus referentialibus ex indice datorum National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtentis comparata. Numeri supra lineas coacervationis indicant opertionem regionis (%), et numeri infra lineas coacervationis longitudinem rami indicant.
Praeterea, ad pathogenicitatem confirmandam, quattuor isolata *S. sclerotiorum* obtenta ad inoculandam cultivarem fabae commercialem susceptibilem *Giza 3* sub condicionibus tepidarii adhibita sunt, quod cum postulatis Kochii congruit (Figura 1E). Quamquam omnia isolata fungica obtenta pathogena erant et fabam viridem (cv. Giza 3) inficere poterant, symptomata typica mucoris albi in omnibus partibus supra terram causantes (Figura 1F), praesertim in caulibus (Figura 1G) et siliquis (Figura 1H) decem diebus post inoculationem (dpi), isolata 3 isolata aggressivissima in duobus experimentis independentibus erat. Isolata 3 maximam gravitatem morbi (%) in plantis fabae habuit (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, et 76.7 ± 3.1 7, 14, et 21 diebus post infectionem, respective; Figura 1F).
Identificatio stirpis S. sclerotiorum tertiae, quae maxime invasivae sunt, ulterius confirmata est, fretus ordinatione internum transcriptionis spacer (ITS) (Fig. 1I). Analysis phylogenetica inter stirpem tertiam et viginti stirpes/stirpes referentiales magnam similitudinem (>99%) ostendit. Notandum est stirpem S. sclerotiorum tertiam (533 bp) magnam similitudinem habere cum stirpe Americana S. sclerotiorum LPM36, quae ex seminibus pisorum siccis segregata est (numerus accessionis GenBank MK896659.1; 540 bp) et stirpe Sinensi S. sclerotiorum YKY211 (numerus accessionis GenBank OR206374.1; 548 bp), quae putredinem caulis Matthiolae incanae (violetae) efficit, quae omnes separatim in summo dendrogrammatis congregantur (Figura 1I). Nova series in basi datorum NCBI deposita est et "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (numerus accessionis GenBank PV202792) nominata est. Patet isolatum 3 esse isolatum maxime invasivum; ergo, hoc isolatum ad studium in omnibus experimentis subsequentibus electum est.
Actio antibacterialis diamini L-ornithini (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) variis concentrationibus (12.5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) contra isolatum 3 *S. sclerotiorum* in vitro investigata est. Notandum est L-ornithinum effectum antibacterialem exercuisse et gradatim incrementum radiale hypharum *S. sclerotiorum* modo dosis dependente inhibuisse (Figura 2A, B). Maxima concentratione probata (125 mg/L), L-ornithinum maximam ratem inhibitionis incrementi mycelii (99.62 ± 0.27%; Figura 2B) demonstravit, quae fungicida commerciali Rizolex-T (rate inhibitionis 99.45 ± 0.39%; Figura 2C) maximo concentratione probata (10 mg/L) aequivalebat, similem efficaciam indicans.
Figura 2. In vitro activitas antibacterialis L-ornithini contra Sclerotiniam sclerotiorum. (A) Comparatio activitatis antibacterialis diversarum concentrationum L-ornithini contra S. sclerotiorum cum fungicida commerciali Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Ratio inhibitionis (%) accretionis mycelii S. sclerotiorum post curationem cum diversis concentrationibus L-ornithini (12.5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) vel Rizolex-T (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L), respective. Valores mediam ± deviationem standardem quinque replicationum biologicarum repraesentant (n = 5). Litterae diversae differentias statisticas inter curationes denotant (p < 0.05). (D, E) Analysis regressionis secundum exemplar probit L-ornithini et fungicidae commercialis Rizolex-T, respective. Linea regressionis exemplaris probit linea caerulea continua ostenditur, et intervallum fiduciae (95%) linea rubra punctata demonstratur.
Praeterea, analysis regressionis probit peracta est et diagrammata correspondentia in Tabula 1 et Figuris 2D,E monstrantur. Breviter, valor declivis acceptabilis (y = 2.92x − 4.67) et statisticae significantes associatae (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 et p < 0.0001; Figura 2D) L-ornithini indicaverunt actionem antifungalem auctam contra S. sclerotiorum comparatam cum fungicida commerciali Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 et p < 0.0001) (Tabula 1).
Tabula 1. Valores semi-maximae concentrationis inhibitoriae (IC50) et IC99 (mg/l) L-ornithini et fungicidi commercialis "Rizolex-T" contra S. sclerotiorum.
Summa summarum, L-ornithinum (250 mg/L) significanter progressionem et gravitatem mucoris albi in plantis fabae vulgaris tractatis, comparatis cum plantis non tractatis a *S. sclerotiorum* infectis (control; Figura 3A), minuit. Breviter, quamquam gravitas morbi in plantis non tractatis infectis gradatim aucta est (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, et 92.33 ± 3.06%), L-ornithinum gravitatem morbi (%) per totum experimentum significanter minuit (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, et 26.36 ± 3.07) diebus 7, 14, et 21 post curationem (dpt), respective (Figura 3A). Similiter, cum plantae fabae a *S. sclerotiorum* infectae 250 mg/L L-ornithino tractatae sunt, area sub curva progressionis morbi (AUDPC) ab 1274.33 ± 33.13 in exemplo non tractato ad 281.03 ± 7.95 decrevit, quod paulo inferius erat quam in exemplo positivo fungicidae *Rizolex-T* 50 mg/L (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Eadem inclinatio in secundo experimento observata est.
Fig. 3. Effectus applicationis exogenae L-ornithini in evolutionem putredinis albae fabae communis a Sclerotinia sclerotiorum causatae sub condicionibus tepidarii. (A) Curva progressionis morbi mucoris albi fabae communis post curationem cum 250 mg/L L-ornithini. (B) Area sub curva progressionis morbi (AUDPC) mucoris albi fabae communis post curationem cum L-ornithino. Valores repraesentant mediam ± deviationem standardem quinque replicationum biologicarum (n = 5). Litterae diversae denotant differentias statistice significantes inter curationes (p < 0.05).
Applicatio exogena 250 mg/L L-ornithini altitudinem plantae (Fig. 4A), numerum ramorum per plantam (Fig. 4B), et numerum foliorum per plantam (Fig. 4C) post dies 42 gradatim auxit. Dum fungicida commercialis Rizolex-T (50 mg/L) maximum effectum in omnibus parametris nutritionalibus investigatis habuit, applicatio exogena 250 mg/L L-ornithini secundum maximum effectum comparata cum testibus non tractatis habuit (Fig. 4A-C). Ex altera parte, curatio L-ornithino nullum effectum significantem in pigmentorum photosyntheticorum chlorophylli a (Fig. 4D) et chlorophylli b (Fig. 4E) habuit, sed leviter contentum carotenoidum totale auxit (0.56 ± 0.03 mg/g ponderis naturalis) comparatum cum exemplo negativo (0.44 ± 0.02 mg/g ponderis naturalis) et exemplo positivo (0.46 ± 0.02 mg/g ponderis naturalis; Fig. 4F). Summa summarum, haec eventa indicant L-ornithinum non esse phytotoxicum leguminibus tractatis et etiam incrementum eorum stimulare posse.
Fig. 4. Effectus applicationis L-ornithini exogeni in proprietates incrementi et pigmenta photosynthetica foliorum fabae infectarum cum Sclerotinia sclerotiorum sub condicionibus tepidarii. (A) Altitudo plantae (cm), (B) Numerus ramorum per plantam, (C) Numerus foliorum per plantam, (D) Contentum chlorophylli a (mg g-1 fr wt), (E) Contentum chlorophylli b (mg g-1 fr wt), (F) Contentum carotenoidum totale (mg g-1 fr wt). Valores sunt media ± deviatio standardis quinque replicationum biologicarum (n = 5). Litterae diversae differentias statistice significantes inter curationes indicant (p < 0.05).
Localizatio histochemica in situ specierum oxygenii reactivarum (ROS; expressae ut hydrogenii peroxidum [H2O2]) et radicalium liberorum (expressi ut aniones superoxidi [O2•−]) revelavit applicationem exogenam L-ornithini (250 mg/L) accumulationem H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) et O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) significanter reduxisse comparata cum accumulatione tam plantarum infectarum non tractatarum (173.31 ± 12.06 et 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, respective) quam plantarum tractatarum cum 50 mg/L fungicidi commercialis Rizolex-T (170.12 ± 9.50 et 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, respective) post 72 horas. Altae quantitates H₂O₂ et O₂•− sub hypertensione (hpt) accumulatae sunt (Fig. 5A, B). Similiter, experimentum malondialdehydi (MDA) in TCA fundatum ostendit plantas fabae a S. sclerotiorum infectas maiores quantitates MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g ponderis fr) in foliis suis accumulavisse (Fig. 5C). Attamen, applicatio exogena L-ornithini peroxidationem lipidorum significanter minuit, ut demonstratur diminutione contenti MDA in plantis tractatis (33.08 ± 4.00 nmol.g ponderis fr).
Fig. 5. Effectus applicationis L-ornithini exogeni in indices praecipuos tensionis oxidativae et mechanismos defensionis antioxidantis non-enzymaticos in foliis fabae infectis cum S. sclerotiorum post 72 horas post infectionem sub condicionibus tepidarii. (A) Hydrogenii peroxidum (H2O2; nmol g−1 FW) ad 72 hpt, (B) anion superoxidi (O2•−; nmol g−1 FW) ad 72 hpt, (C) malondialdehydum (MDA; nmol g−1 FW) ad 72 hpt, (D) phenola solubilia totalia (mg GAE g−1 FW) ad 72 hpt, (E) flavonoida solubilia totalia (mg RE g−1 FW) ad 72 hpt, (F) aminoacida libera totalia (mg g−1 FW) ad 72 hpt, et (G) contentum prolini (mg g−1 FW) ad 72 hpt. Valores mediam ± deviationem standardem (mediam ± deviationem standardem) quinque replicationum biologicarum (n = 5) repraesentant. Litterae diversae differentias statistice significantes inter curationes indicant (p < 0.05).