Antehac nuntiavimus gradus sericos metaboliti tryptophani ex intestino derivati, acidi indoli-3-propionici (IPA), inferiores esse in aegris cum fibrosi hepatica. In hoc studio, transcriptoma et methyloma DNA in hepatibus obesis investigavimus pro relatione ad gradus IPA sericos, necnon munus IPA in inducenda inactivatione phenotypica cellularum stellatarum hepaticarum (HSCs) in vitro.
In studio inclusi sunt 116 aegroti obesi sine diabete mellito typi 2 (T2DM) (aetate 46.8 ± 9.3 annorum; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) qui chirurgiam bariatricam in Centro Chirurgiae Bariatricae Kuopio (KOBS) subierunt. Gradus IPA circulantes per chromatographiam liquidam-spectrometriam massae (LC-MS) mensi sunt, analysis transcriptomi hepatici per sequentiationem RNA totalem peracta est, et analysis methylationis DNA utens Infinium HumanMethylation450 BeadChip peracta est. Cellulae stellatae hepaticae humanae (LX-2) ad experimenta in vitro adhibitae sunt.
Gradus IPA in sero cum expressione genorum quae in viis apoptoticis, mitophagicis, et longevitatis hepatis implicantur congruebant. Gen AKT serinae/threoninae kinasis 1 (AKT1) gen interagens abundantissimum et dominantissimum in transcriptione hepatica et methylatione DNA fuit. Curatio IPA apoptosis induxit, respirationem mitochondrialem imminuit, et morphologiam cellularum ac dynamicam mitochondrialem mutavit modulando expressionem genorum quae fibrosis, apoptosis, et superviventiam cellularum LX-2 moderari sciuntur.
Haec data simul sumpta confirmant IPA potentialia effectus therapeuticos habere et apoptosis inducere atque phaenotypum HSC versus statum inactivum mutare posse, ita possibilitatem inhibendi fibrosis hepatis per interferendum cum activatione HSC et metabolismo mitochondriali amplificando.
Frequentia obesitatis et syndromae metabolicae cum crescente incidentia morbi hepatis pinguis metabolice associati (MASLD) coniuncta est; morbus 25% ad 30% populationis generalis afficit [1]. Consequentia principalis aetiologiae MASLD est fibrosis hepatica, processus dynamicus accumulatione continua matricis extracellularis fibrosae (ECM) insignitus [2]. Cellulae principales in fibrosi hepatica implicatae sunt cellulae stellatae hepaticae (HSCs), quae quattuor phenotypes notos exhibent: quiescentes, activatas, inactivatas et senescentes [3, 4]. HSCs activari et transdifferentiationem a forma quiescente in cellulas proliferativas fibroblasto-similes cum magnis postulationibus energiae, cum expressione aucta α-actini musculi levis (α-SMA) et collageni typi I (Col-I) [5, 6], per reversionem fibrosis hepaticae, HSCs activatae per apoptosin vel inactivationem eliminantur. Hae actiones includunt deregulationem genorum fibrogenicorum et modulationem genorum prosurvival (sicut viae signalationis NF-κB et PI3K/Akt) [7, 8], necnon mutationes in dynamica et functione mitochondriali [9].
Gradus serici metaboliti tryptophani, acidi indoli-3-propionici (IPA), in intestino producti, diminuti in morbis metabolicis humanis, incluso MASLD [10-13], inventa sunt. IPA cum fibrae alimentariae consumptione coniungitur, propter effectus antioxidantes et anti-inflammatorios notum est, et phaenotypum steatohepatitidis non-alcoholicae (NASH) a diaeta inductam in vivo et in vitro attenuat [11-14]. Quaedam indicia ex studio nostro priori proveniunt, quod demonstravit gradus IPA serici inferiores fuisse in aegris cum fibrosi hepatica quam in aegris obesis sine fibrosi hepatica in Studio Chirurgiae Bariatricae Kuopio (KOBS). Praeterea, demonstravimus curationem IPA expressionem genorum, quae sunt indices classici adhaesionis cellularis, migrationis cellularis et activationis cellularum haematopoieticarum primordialium in modelo cellulae stellatae hepaticae humanae (LX-2), reducere posse et esse metabolitum hepatoprotectorium potentiale [15]. Attamen, incertum manet quomodo IPA regressionem fibrosis hepaticae inducat per activationem apoptosis HSC et bioenergeticae mitochondrialis.
Hic demonstramus IPA serum cum expressione genorum locupletatorum in viis apoptosis, mitophagiae, et longivitatis in hepate individuorum obesorum sed non diabete typi 2 (KOBS) coniunctum esse. Praeterea, invenimus IPA purgationem et degradationem cellularum haematopoieticarum primordialium activarum (HSCs) per viam inactivationis inducere posse. Haec eventa novum munus IPA revelant, idque potentialem scopum therapeuticum ad regressionem fibrosis hepatis promovendam facientes.
Studium prius in cohorte KOBS demonstravit aegros cum fibrosi hepatica inferiores gradus IPA circulantes habuisse comparatos cum aegrotis sine fibrosi hepatica [15]. Ad potentialem effectum confundentem diabetae typi 2 excludendum, 116 aegros obesos sine diabete typi 2 (aetas media ± SD: 46.8 ± 9.3 anni; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabula 1) ex studio KOBS in progressu ut populationem studii conscripsimus [16]. Omnes participes consensum informatum scriptum dederunt et protocollum studii a Commissione Ethica Nosocomii Comitatus Savo Septentrionalis secundum Declarationem Helsingiensem (54/2005, 104/2008 et 27/2010) approbatum est.
Biopsiae hepaticae per chirurgiam bariatricam captae et a pathologis peritis histologice aestimatae sunt secundum criteria antea descripta [17, 18]. Criteria aestimationis in Tabula Supplementi S1 summatim exponuntur et antea descripta sunt [19].
Exempla serorum ieiuniorum per chromatographiam liquidam sine scopo cum spectrometria massae (LC-MS) ad analysin metabolomicam (n = 116) analysata sunt. Exempla per systema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germania) analysata sunt, ut antea descriptum est19. Identificatio alcoholis isopropylici (IPA) in tempore retentionis et comparatione spectri MS/MS cum puris normis fundata est. Intensitas signi IPA (area cacuminis) in omnibus analysibus ulterioribus considerata est [20].
Sequentiatio RNA totius hepatis peracta est utens Illumina HiSeq 2500 et data praeprocessa sunt ut antea descriptum est [19, 21, 22]. Analysin expressionis differentialis directam transcriptionum functionem/biogenesin mitochondrialem afficientium perfecimus utens 1957 genis selectis ex database MitoMiner 4.0 [23]. Analysis methylationis DNA hepatis peracta est utens Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) eadem methodologia utens ac antea descripta [24, 25].
Cellulae stellatae hepaticae humanae (LX-2) a Professore Stefano Romeo benigne donatae sunt, et in medio DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) cultae et conservatae sunt. Ad dosis operativa IPA eligendam, cellulae LX-2 variis IPA concentrationibus (10 μM, 100 μM et 1 mM; Sigma, 220027) in medio DMEM/F12 per 24 horas tractatae sunt. Praeterea, ad facultatem IPA HSCs inactivandi investigandam, cellulae LX-2 cum 5 ng/ml TGF-β1 (systemata R&D, 240-B-002/CF) et 1 mM IPA in medio sine sero per 24 horas co-tractatae sunt. Pro testibus vehiculi correspondentibus, 4 nM HCL cum 0.1% BSA ad curationem TGF-β1 et 0.05% DMSO ad curationem IPA adhibita sunt, et ambo simul ad curationem compositam adhibita sunt.
Apoptosis aestimata est utens FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit cum 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) secundum instructiones fabricatoris. Breviter, LX-2 (1 × 10⁵ cellulae/puteo) per noctem in laminis 12 puteorum cultae sunt, deinde multis dosibus IPA vel IPA et TGF-β1 tractatae. Die sequenti, cellulae natantes et adhaerentes collectae, trypsinizatae, PBS lavatae, in liquore Annexin V ligante resuspensae, et cum FITC-Annexin V et 7-AAD per 15 minuta incubatae sunt.
Mitochondria in cellulis viventibus ad activitatem oxidativam tinguntur utens Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Ad probationes MTR, cellulae LX-2 aequalibus densitatibus cum IPA et TGF-β1 incubatae sunt. Post 24 horas, cellulae viventes trypsinizationi subiectae sunt, cum PBS ablutae, et deinde cum 100 μM MTR in medio sine sero ad 37°C per 20 minuta incubatae sunt ut antea descriptum est [26]. Ad analysin morphologiae cellularum viventium, magnitudo cellularum et complexitas cytoplasmatica utens parametris dispersionis anterioris (FSC) et dispersionis lateralis (SSC) respective analysatae sunt.
Omnia data (eventuum XXX milia) per NovoCyte Quanteon (Agilent) acquisita et per programmata NovoExpress® 1.4.1 vel FlowJo V.10 analysata sunt.
Consumptio oxygenii (OCR) et acidificatio extracellularis (ECAR) tempore reali mensuratae sunt utens Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) instructo Seahorse XF Cell Mito Stress secundum instructiones fabricatoris. Breviter, 2 × 10⁴ cellulae LX-2/puteo in laminas culturae cellularum XF96 seminatae sunt. Post incubationem nocturnam, cellulae cum isopropanolo (IPA) et TGF-β1 tractatae sunt (Methodi Supplementariae 1). Analysis datorum peracta est utens programmate Seahorse XF Wave, quod includit Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Ex hoc, Index Salutis Bioenergeticae (BHI) calculatus est [27].
RNA totalis in cDNA transcripta est. De methodis specificis, vide referentiam [15]. Gradus mRNA proteini acidici ribosomalis P0 humani 60S (RPLP0) et cyclophilini A1 (PPIA) ut moderamina genorum constitutiva adhibiti sunt. Systema PCR Real-Time QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederlandia) cum TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) vel Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) adhibitum est, et relativa plicatio expressionis genorum calculata est utens parametris cyclicis valoris Ct comparativi (ΔΔCt) et methodo ∆∆Ct. Singula de primeris in Tabulis Supplementis S2 et S3 praebentur.
DNA nuclearis (ncDNA) et DNA mitochondrialis (mtDNA) extracta sunt utens apparatu sanguinis et textus DNeasy (Qiagen) ut antea descriptum est [28]. Quantitas relativa mtDNA calculata est calculando rationem cuiusque regionis mtDNA destinatae ad mediam geometricam trium regionum DNA nuclearis (mtDNA/ncDNA), ut in Methodis Supplementis 2 explicatur. Singula de initiis pro mtDNA et ncDNA in Tabula Supplementi S4 dantur.
Cellulae vivae tinctae sunt Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ad retia mitochondrialia intercellularia et intracellularia visualizanda. Cellulae LX-2 (1 × 10⁴ cellulae/puteo) in laminis vitreis in patellis culturae fundo vitreo correspondentibus (Ibidi GmbH, Martinsried, Germania) cultae sunt. Post 24 horas, cellulae LX-2 vivae cum 100 μM MTR per 20 min ad 37°C incubatae sunt et nuclei cellularum DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) tincti sunt ut antea descriptum est [29]. Retia mitochondrialia visualizata sunt utens microscopio inverso Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania) instructo modulo confocali Zeiss LSM 800 ad 37°C in atmosphaera humidificata cum 5% CO2 utens obiectivo 63×NA 1.3. Decem imagines seriei Z pro quolibet genere exempli acquisivimus. Quaeque series Z triginta sectiones continet, quarum singulae crassitudinem 9.86 μm habent. Pro quolibet exemplo, imagines decem diversorum camporum visionis per programmatum ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Iena, Germania) acquisitae sunt, et analysis morphologiae mitochondrialis per programmatum ImageJ (v1.54d) [30, 31] secundum parametros in Methodis Supplementis 3 descriptos peracta est.
Cellulae glutaraldehydo 2% in 0.1 M solutione phosphatis tamponatae fixae sunt, deinde solutione osmii tetroxidi 1% (Sigma Aldrich, MO, USA) fixatae, acetono gradatim dehydratae (Merck, Darmstadt, Germania), et denique resina epoxydica inclusae. Sectiones tenuissimae praeparatae et uranyli acetato 1% (Merck, Darmstadt, Germania) et plumbi citrato 1% (Merck, Darmstadt, Germania) tinctae sunt. Imagines ultrastructurales microscopio electronico transmissionis JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Iaponia) tensione accelerante 80 kV obtentae sunt.
Morphologia cellularum LX-2, IPA per 24 horas tractatarum, microscopio luminoso inverso Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 et AxioCam MRm, Iena, Germania) adhibito analysata est.
Data clinica expressa sunt ut media ± deviatio standardis vel mediana (ambitus interquartile: IQR). Analysis variantiae unidirectionalis (variabiles continuae) vel probatio χ² (variabiles categoricae) adhibita est ad differentias inter tres greges studii comparandas. Ratio falso positivorum (FDR) adhibita est ad probationes multiplices corrigendas, et gena cum FDR < 0.05 statistice significativa habita sunt. Analysis correlationis Spearman adhibita est ad methylationem DNA CpG cum intensitate signi IPA correlandam, cum valoribus p nominalibus (p < 0.05) relatis.
Analysis semitarum peracta est instrumento interretiali ad genes analyzandos (WebGestalt) pro 268 transcriptis (p nominali < 0.01), 119 transcriptis mitochondriis associatis (p nominali < 0.05), et 4350 CpG ex 3093 transcriptis hepaticis quae cum gradibus IPA in sero circulante associatae erant. Instrumentum gratis praesto Venny DB (versio 2.1.0) ad invenienda gena congruentia adhibitum est, et StringDB (versio 11.5) ad interactiones inter proteinum et proteinum visualizandas adhibitum est.
Pro experimento LX-2, exempla ad normalitatem examinata sunt utens probatione D'Agostino-Pearson. Data ex saltem tribus replicationibus biologicis obtenta et ANOVA unidirectionali cum probatione Bonferroni post hoc subiecta sunt. Valor p minor quam 0.05 statistice significans habitus est. Data exhibentur ut media ± SD, et numerus experimentorum in unaquaque figura indicatur. Omnes analyses et grapha peracta sunt utens programmate statistico GraphPad Prism 8 pro Windows (GraphPad Software Inc., versio 8.4.3, San Diego, USA).
Primo, nexum inter gradus IPA in sero et transcriptiones hepatis, totius corporis, et mitochondriales investigavimus. In profilo transcriptionum totali, gen fortissimum cum gradibus IPA in sero associatum erat MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); in profilo transcriptionum mitochondriis relato, gen fortissimum associatum erat AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Lima addita 1 et Lima addita 2).
Deinde transcripta globalia (n = 268; p < 0.01) et transcripta mitochondriis associata (n = 119; p < 0.05) analyzavimus, apoptosis tandem ut viam canonicam significantissimam (p = 0.0089) identificantes. Pro transcriptis mitochondrialibus cum gradibus IPA sericis associatis, apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagiam (FDR = 0.00029), et vias signalationis TNF (FDR = 0.000006) operam dedimus (Figura 1A, Tabula 2, et Figurae Supplementares 1A-B).
Analysis imbricata transcriptionum globalium, mitochondriis associatarum, et methylationis DNA in hepate humano in associatione cum gradibus IPA sericis. A repraesentat 268 transcriptiones globales, 119 transcriptiones mitochondriis associatas, et transcriptiones DNA methylatas quae ad 3092 locos CpG cum gradibus IPA sericis associatos mappantur (valores p < 0.01 pro transcriptionibus globalibus et DNA methylato, et valores p < 0.05 pro transcriptionibus mitochondrialibus). Transcripta imbricata praecipua in medio monstrantur (AKT1 et YKT6). B Tabula interactionis 13 genorum cum maximo puncto interactionis (0.900) cum aliis genis constructa est ex 56 genis imbricatis (regione lineae nigrae) quae significanter cum gradibus IPA sericis associata sunt utens instrumento interretiali StringDB. Viridis: Gena mappata ad componentem cellularem Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 est proteinum quod, secundum data (ex investigatione textuum, experimentis, databasibus, et co-expressione) constat, maximum punctum (0.900) habet in interactionibus cum aliis proteinis. Nodi retiales proteinas repraesentant, margines autem nexus inter proteinas repraesentant.
Cum metabolitae microbiotae intestinalis compositionem epigeneticam per methylationem DNA moderari possint [32], investigavimus utrum gradus IPA serici cum methylatione DNA hepatici coniuncti essent. Invenimus duos locos methylationis praecipuos cum gradibus IPA sericis coniunctos prope regionem 3, prolino-serino divitem, (C19orf55) et familiam proteinorum ictus caloris B (parvum) membrum 6 (HSPB6) esse (fasciculus additus 3). Methylatio DNA 4350 CpG (p < 0.01) cum gradibus IPA sericis correlata erat et in viis regulatoriis longivitatis locupletata erat (p = 0.006) (Figura 1A, Tabula 2, et Figura Suppletoria 1C).
Ad intellegendos mechanismos biologicos subiacentes associationibus inter gradus IPA serici, transcripta globalia, transcripta mitochondriis associata, et methylationem DNA in hepate humano, analysin superpositionis genorum in priore analysi viarum identificatorum (Figura 1A) perfecimus. Resultata analysis locupletationis viarum 56 genorum superpositorum (intra lineam nigram in Figura 1A) demonstraverunt viam apoptoticam (p = 0.00029) duo gena communia tribus analysibus illustrare: AKT1 et YKT6 (homologus YKT6 v-SNARE), ut in diagramma Venn demonstratur (Figura Supplementaria 2 et Figura 1A). Interesse est quod invenimus AKT1 (cg19831386) et YKT6 (cg24161647) positive correlata esse cum gradibus IPA sericis (fasciculus additus 3). Ad potentiales interactiones proteinorum inter producta genorum identificandas, 13 gena cum maximo communi regione puncto (0.900) inter 56 gena superpositora ut input delegimus et mappam interactionis construximus. Secundum gradum fiduciae (fiducia marginalis), gen AKT1 cum maximo puncto (0.900) summum locum habuit (Figura 1B).
Ex analysi semitarum, apoptosis viam principalem invenimus, itaque investigavimus num curatio IPA apoptosis cellularum stemmatocelularum (HSCs) in vitro afficeret. Ante demonstravimus diversas doses IPA (10 μM, 100 μM, et 1 mM) cellulis LX-2 non toxicas esse [15]. Hoc studium ostendit curationem IPA ad 10 μM et 100 μM numerum cellularum viabilium et necroticarum auxisse. Tamen, comparatione cum grege testigo, viabilitas cellularum ad 1 mM concentrationem IPA decrevit, dum ratio necrosis cellularum immutata mansit (Figura 2A, B). Deinde, ut optimam concentrationem ad apoptosis in cellulis LX-2 inducendam inveniremus, 10 μM, 100 μM, et 1 mM IPA per 24 horas probavimus (Figura 2A-E et Figura Supplementaria 3A-B). Curiose, IPA 10 μM et 100 μM ratem apoptoseos (%) imminuerunt. Attamen IPA 1 mM apoptoseos tardam et ratem apoptoseos (%) comparatione cum testibus auxit, ideoque ad experimenta ulteriora electa est (Figurae 2A-D).
IPA apoptosis cellularum LX-2 inducit. Methodus duplicis tinctionis Annexini V et 7-AAD ad quantificandam ratem apoptoticam et morphologiam cellularum per cytometriam fluxus adhibita est. Cellulae BA cum 10 μM, 100 μM et 1 mM IPA per 24 horas vel cum F–H TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM IPA in medio sine sero per 24 horas incubatae sunt. A: cellulae viventes (Annexin V -/ 7AAD-); B: cellulae necroticae (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: praecox (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: tardus (Annexin V+/7AAD.+); E, H: percentatio cellularum apoptoticarum praecocium et tardorum totalium in rate apoptotica (%). Data exprimuntur ut media ± SD, n = 3 experimenta independentia. Comparationes statisticae per ANOVA unidirectionalem cum probatione Bonferroni post hoc factae sunt. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Ut antea demonstravimus, 5 ng/ml TGF-β1 activationem HSC inducere potest per expressionem genorum classicorum indicatorum augendam [15]. Cellulae LX-2 cum 5 ng/ml TGF-β1 et 1 mM IPA in combinatione tractatae sunt (Fig. 2E–H). Curatio TGF-β1 ratem apoptoseos non mutavit, tamen, co-curatio IPA apoptoseos tardas et ratem apoptoseos (%) auxit comparata cum curatione TGF-β1 (Fig. 2E–H). Haec eventa indicant 1 mM IPA apoptoseos in cellulis LX-2 promovere posse independenter ab inductione TGF-β1.
Effectum IPA in respirationem mitochondrialem cellulis LX-2 porro investigavimus. Resultata demonstraverunt 1 mM IPA parametros consumptionis oxygenii (OCR): respirationem non-mitochondrialem, respirationem basalem et maximalem, effusionem protonum et productionem ATP, comparatione cum grege testigo (Figura 3A, B), imminuisse, dum index sanitatis bioenergeticae (BHI) non mutatus est.
IPA respirationem mitochondrialem in cellulis LX-2 minuit. Curva respirationis mitochondrialis (OCR) per parametri respirationis mitochondrialis (respiratio non-mitochondrialis, respiratio basalis, respiratio maxima, effusio protonum, generatio ATP, SRC et BHI) exhibetur. Cellulae A et B cum 10 μM, 100 μM et 1 mM IPA per 24 horas, respective, incubatae sunt. Cellulae C et D cum TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM IPA in medio sine sero per 24 horas, respective, incubatae sunt. Omnes mensurae ad contentum DNA per apparatum CyQuant normalizatae sunt. BHI: index sanitatis bioenergeticae; SRC: capacitas reservata respiratoria; OCR: ratio consumptionis oxygenii. Data per media ± deviationem standardem (SD), n = 5 experimenta independentia exhibentur. Comparationes statisticae per ANOVA unidirectionalem et probationem Bonferroni post hoc factae sunt. *p < 0.05; **p < 0.01; et ***p < 0.001.
Ut plenius intellegeretur effectus IPA in profilum bioenergeticum cellularum LX-2 a TGF-β1 activatarum, phosphorylationem oxidativam mitochondrialem per OCR (Fig. 3C,D) analyzavimus. Resultata demonstraverunt curationem TGF-β1 respirationem maximam, capacitatem reservatam respiratoriam (SRC) et BHI (Bhill Hydroxyhepatitis Inhibition) reducere posse, comparatione cum grege testigo (Fig. 3C,D). Praeterea, curatio composita respirationem basalem, effusionem protonum et productionem ATP diminuit, sed SRC et BHI significanter altiores erant quam eorum qui cum TGF-β1 tractati sunt (Fig. 3C,D).
Etiam "Examen Phenotypi Energiae Cellularis" a programmate Seahorse provisum (Figura Supplementaria 4A-D) perfecimus. Ut in Figura Supplementaria 3B demonstratur, potentialia metabolica et OCR et ECAR post curationem TGF-β1 imminuta sunt, nihilominus nulla differentia in gregibus curationis combinatae et IPA comparatis cum grege testigo observata est. Praeterea, et gradus basales et stress OCR post curationem combinatam et IPA comparatis cum grege testigo imminuti sunt (Figura Supplementaria 4C). Curiose, simile exemplum cum therapia combinata observatum est, ubi nulla mutatio in gradibus basalibus et stress ECAR comparata cum curatione TGF-β1 observata est (Figura Supplementaria 4C). In HSCs, reductio phosphorylationis oxidativae mitochondrialis et facultas curationis combinatae ad SCR et BHI restituendum post expositionem curationi TGF-β1 potentialia metabolica (OCR et ECAR) non mutaverunt. Haec omnia simul sumpta indicant IPA bioenergeticam in HSCs minuere posse, quod suggerit IPA profile energeticum inferiorem inducere posse qui phaenotypum HSC versus inactivationem mutat (Figura Supplementaria 4D).
Effectus IPA in dynamica mitochondriali investigatus est per quantificationem tridimensionalem morphologiae mitochondrialis et nexuum retium necnon tinctionem MTR (Figura 4 et Figura Supplementaria 5). Figura 4 ostendit curationem TGF-β1, comparatam cum grege testigo, aream superficialem mediam, numerum ramorum, longitudinem totalem ramorum, et numerum iunctionum ramorum diminuisse (Figura 4A et B) et proportionem mitochondriorum a morphologia sphaerica ad intermediam mutasse (Figura 4C). Sola curatio IPA volumen mitochondriale medium diminuit et proportionem mitochondriorum a morphologia sphaerica ad intermediam mutavit comparata cum grege testigo (Figura 4A). Contra, sphaericitas, longitudo media ramorum, et activitas mitochondrialis aestimata per MTR dependentem a potentia membranae mitochondrialis (Figura 4A et E) immutata manserunt et hi parametri non differebant inter greges. Haec simul sumpta, suggerunt curationem TGF-β1 et IPA formam et magnitudinem mitochondrialem necnon complexitatem retium in cellulis LX-2 viventibus modulare videri.
IPA dynamicam mitochondrialem et abundantiam DNA mitochondrialis in cellulis LX-2 mutat. A. Imagines confocales repraesentativae cellularum LX-2 vivarum incubatarum cum TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM IPA per 24 horas in medio sine sero, retia mitochondrialia tincta cum Mitotracker™ Red CMXRos et nucleos caeruleo tinctos cum DAPI ostendentes. Omnia data saltem 15 imagines per gregem continebant. Decem imagines Z-stack pro quolibet typo exempli acquisivimus. Quaelibet sequentia Z-axis 30 segmenta continebat, quarum unaquaeque crassitudine 9.86 μm habebat. Scala: 10 μm. B. Obiecta repraesentativa (mitochondria tantum) identificata per applicationem liminis adaptivi ad imaginem. Analysis quantitativa et comparatio nexuum morphologicorum retium mitochondrialium pro omnibus cellulis in quolibet grege peracta est. C. Frequentia proportionum formarum mitochondrialium. Valores prope 0 formas sphaericas indicant, et valores prope 1 formas filamentosas indicant. D Contentum DNA mitochondrialis (mtDNA) determinatum est ut in Materialibus et Methodis descriptum est. Analysis E Mitotracker™ Red CMXRos per cytometriam fluxus (eventus 30,000) peracta est, ut in "Materiis et Methodis" descriptum est. Data ut media ± deviatio standardis, n = 3 experimenta independentia, exhibentur. Comparationes statisticae per ANOVA unidirectionalem et probationem Bonferroni post hoc factae sunt. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Deinde contentum mtDNA in cellulis LX-2 ut indicem numeri mitochondrialis analyzavimus. Comparatum cum grege testigo, contentum mtDNA auctum est in grege TGF-β1 tractato (Figura 4D). Comparatum cum grege TGF-β1 tractato, contentum mtDNA diminutum est in grege curationis combinatae (Figura 4D), quod suggerit IPA contentum mtDNA et fortasse numerum mitochondrialem necnon respirationem mitochondrialem reducere posse (Figura 3C). Praeterea, IPA contentum mtDNA in curatione combinata reducere videbatur, sed actionem mitochondrialem MTR-mediatam non affecit (Figurae 4A-C).
Nexus IPA cum gradibus mRNA genorum cum fibrosi, apoptosi, superviventia, et dynamica mitochondriali in cellulis LX-2 consociatorum investigavimus (Figura 5A-D). Comparatus cum grege testigo, grex TGF-β1 tractatus expressionem auctam genorum ostendit, ut catenae α2 collageni typi I (COL1A2), α-actini musculi levis (αSMA), metalloproteinasis matricis 2 (MMP2), inhibitoris textus metalloproteinasis 1 (TIMP1), et geni similis dynamini 1 (DRP1), fibrosis et activationem auctam indicans. Praeterea, comparatus cum grege testigo, curatio TGF-β1 gradus mRNA receptoris pregnani X nuclearis (PXR), caspasis 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitoris α cellularum B, amplificatoris peptidi lucis geni factoris κ nuclearis (NFκB1A), et inhibitoris subunitatis β kinasis factoris κB nuclearis (IKBKB) reduxit (Figura 5A-D). Comparata cum curatione TGF-β1, curatio composita cum TGF-β1 et IPA expressionem COL1A2 et MMP2 minuit, sed gradus mRNA PXR, TIMP1, lymphoma-2 cellularum B (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, et IKBKB auxit. Curatio IPA expressionem MMP2, proteini X associati cum Bcl-2 (BAX), AKT1, proteini atrophiae opticae 1 (OPA1), et proteini fusionis mitochondrialis 2 (MFN2) significanter minuit, dum expressio CASP8, NFκB1A, NFκB1B, et IKBKB comparata cum grege testigo aucta est. Nihilominus, nulla differentia inventa est in expressione caspase-3 (CASP3), factoris apoptotici peptidasis activantis 1 (APAF1), proteini fusionis mitochondrialis 1 (MFN1), et proteini fissionis 1 (FIS1). Haec omnia simul sumpta suggerunt curationem IPA expressionem genorum cum fibrosi, apoptosi, superviventia, et dynamica mitochondriali coniunctorum moderari. Nostra data suggerunt curationem IPA fibrosis in cellulis LX-2 reducere; simul, superviventiam stimulare mutando phaenotypum versus inactivationem.
IPA expressionem genorum fibroblastorum, apoptoticorum, viabilitatis, et dynamicae mitochondrialis in cellulis LX-2 modulat. Histogrammata expressionem mRNA relativam ad moderationem endogenam (RPLP0 vel PPIA) ostendunt postquam cellulae LX-2 cum TGF-β1 et IPA in medio sine sero per 24 horas inductae sunt. A fibroblastos indicat, B cellulas apoptoticas indicat, C cellulas superstites indicat, et D expressionem genorum dynamicae mitochondrialis indicat. Data ut media ± deviatio standard (SD), n = 3 experimenta independentia exhibentur. Comparationes statisticae per ANOVA unidirectionalem et probationem Bonferroni post hoc peractae sunt. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Deinde, mutationes magnitudinis cellularum (FSC-H) et complexitatis cytoplasmaticae (SSC-H) per cytometriam fluxus aestimatae sunt (Figura 6A,B), et mutationes morphologiae cellularum post curationem IPA per microscopiam electronicam transmissionis (TEM) et microscopiam contrastus phasis (Figura Suppletoria 6A-B). Ut expectatum, cellulae in grege TGF-β1 tractato magnitudine auctae sunt comparatae cum grege testigo (Figura 6A,B), ostendentes expansionem classicam reticuli endoplasmatici asperi (ER*) et phagolysosomatum (P), indicantes activationem cellularum haematopoieticarum primordialium (HSC) (Figura Suppletoria 6A). Attamen, comparatae cum grege TGF-β1 tractato, magnitudo cellularum, complexitas cytoplasmatica (Figura 6A,B), et contentum ER* diminutae sunt in grege curationis combinationis TGF-β1 et IPA (Figura Suppletoria 6A). Praeterea, curatio IPA magnitudinem cellularum, complexitatem cytoplasmaticam (Fig. 6A, B), contentum P et ER* (Fig. Supplementaria 6A) comparata cum grege testigo imminuit. Accedit quod contentum cellularum apoptoticarum post 24 horas curationis IPA comparata cum grege testigo auctum est (sagittae albae, Fig. Supplementaria 6B). Haec omnia simul suggerunt 1 mM IPA apoptosin HSC stimulare et mutationes in parametrorum morphologicorum cellularum a TGF-β1 inductas invertere posse, ita magnitudinem et complexitatem cellularum, quae cum inactivatione HSC coniungi possunt, regulans.
IPA magnitudinem cellularum et complexitatem cytoplasmaticam in cellulis LX-2 mutat. Imagines repraesentativae analysis cytometriae fluxus. Analysis strategiam portae specificam pro cellulis LX-2 adhibuit: SSC-A/FSC-A ad definiendam populationem cellularum, FSC-H/FSC-A ad identificandas duplices, et SSC-H/FSC-H ad magnitudinem cellularum et analysin complexitatis. Cellulae cum TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM IPA in medio sine sero per 24 horas incubatae sunt. Cellulae LX-2 in quadrantem inferiorem sinistram (SSC-H-/FSC-H-), quadrantem superiorem sinistram (SSC-H+/FSC-H-), quadrantem inferiorem dextram (SSC-H-/FSC-H+), et quadrantem superiorem dextram (SSC-H+/FSC-H+) ad magnitudinem cellularum et analysin complexitatis cytoplasmaticae distributae sunt. B. Morphologia cellularum per cytometriam fluxus analysata est, utens FSC-H (dispersio anterior, magnitudo cellularum) et SSC-H (dispersio lateralis, complexitas cytoplasmatica) (30 000 eventus). Data exhibentur ut media ± SD, n = 3 experimenta independentia. Comparationes statisticae peractae sunt utens ANOVA unidirectionali et probatione Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 et ****p < 0.0001.
Metabolita intestinalia, ut IPA, res investigationis calida facta sunt, suggerentes novas metas in microbiota intestinali inveniri posse. Itaque interest IPA, metabolitum quem cum fibrosi hepatica in hominibus coniunximus [15], in exemplaribus animalibus potentiale compositum antifibroticum esse demonstratum esse [13, 14]. Hic primum demonstramus associationem inter IPA serica et transcriptomicam hepaticam globalem necnon methylationem DNA in individuis obesis sine diabete typo 2 (T2D), apoptosis, mitophagiam et longivitatem illustrantes, necnon possibilem genem candidatum AKT1 homeostasis hepaticam regulantem. Alia novitas studii nostri est quod interactionem curationis IPA cum apoptosi, morphologia cellulari, bioenergetica mitochondriali et dynamica in cellulis LX-2 demonstravimus, spectrum energiae inferioris indicantes qui phaenotypum HSC versus inactivationem mutat, IPA candidatum potentialem ad fibrosis hepaticam emendandam faciens.
Invenimus apoptosis, mitophagiam, et longivitatem esse vias canonicas maximi momenti, quae genibus hepaticis cum IPA serico circulante consociantur, locupletatas. Perturbatio systematis qualitatis mitochondrialis moderandae (MQC) ad dysfunctionem mitochondrialem, mitophagiam, et apoptosis ducere potest, ita eventum MASLD promovens [33, 34]. Ergo, coniectare possumus IPA in conservatione dynamicae cellularis et integritatis mitochondrialis per apoptosis, mitophagiam, et longivitatem in hepate implicatam esse. Nostra data demonstraverunt duo gena communia esse per tria experimenta: YKT6 et AKT1. Notandum est YKT6 esse proteinum SNARE implicatum in processu fusionis membranae cellularis. Munus agit in autophagia et mitophagia formando complexum initiationis cum STX17 et SNAP29 in autophagosomate, ita fusionem autophagosomatum et lysosomatum promovens [35]. Praeterea, amissio functionis YKT6 mitophagiam impedit [36], dum augmentum YKT6 cum progressione carcinomatis hepatocellularis (HCC) coniungitur, ostendens superviventiam cellularum auctam [37]. Contra, AKT1 est gen interagens gravissimum et munus magnum in morbis hepaticis agit, inter quas via signalis PI3K/AKT, cyclus cellularis, migratio cellularis, proliferatio, adhaesio focalis, functio mitochondrialis, et secretio collageni [38-40]. Via signalis PI3K/AKT activata cellulas haematopoieticas primordiales (HSCs) activare potest, quae sunt cellulae responsabiles pro productione matricis extracellularis (ECM), et eius dysregulatio ad eventum et progressionem fibrosis hepaticae conferre potest [40]. Accedit quod AKT est unus e factoribus clavis superviventiae cellularum qui apoptosis cellularum p53-dependentem inhibet, et activatio AKT cum inhibitione apoptosis cellularum hepaticarum coniungi potest [41, 42]. Resultata obtenta suggerunt IPA in apoptosi mitochondriis hepaticis associata implicari posse, decisionem hepatocytorum inter ingressum in apoptosis vel superviventiam afficiendo. Hi effectus a genis candidatis AKT et/vel YKT6, quae ad homeostasis hepatis necessaria sunt, regi possunt.
Nostrae investigationes demonstraverunt 1 mM IPA apoptosis inducere et respirationem mitochondrialem in cellulis LX-2 imminuisse, independenter a curatione TGF-β1. Notandum est apoptosis viam maiorem esse pro resolutione fibrosis et activatione cellularum haematopoieticarum primordialium (HSC), et etiam eventum clavem in responsione physiologica reversibili fibrosis hepaticae [4, 43]. Praeterea, restitutio BHI in cellulis LX-2 post curationem combinatam novas perspicientias in potentialem munus IPA in regulatione bioenergeticae mitochondrialis praebuit. Sub condicionibus quietis et inactivis, cellulae haematopoieticae normaliter phosphorylationem oxidativam mitochondrialem ad ATP producendum utuntur et activitatem metabolicam humilem habent. Ex altera parte, activatio HSC respirationem et biosynthesis mitochondrialem auget ad compensandum necessitates energiae intrandi statum glycolyticum [44]. Quod IPA potentiam metabolicam et ECAR non affecit suggerit viam glycolyticam minus prioritatem habere. Similiter, aliud studium demonstravit 1 mM IPA validum esse ad activitatem catenae respiratoriae mitochondrialis in cardiomyocytis, stirpe cellularum hepatocytorum humanorum (Huh7) et cellulis endothelialibus venae umbilicalis humanae (HUVEC) moderandam; nihilominus, nullus effectus IPA in glycolysin in cardiomyocytis inventus est, quod suggerit IPA bioenergeticam aliorum generum cellularum afficere posse [45]. Quapropter, coniecimus 1 mM IPA posse agere ut dissociator chemicus lenis, cum expressionem genorum fibrogenicam, morphologiam cellularum et bioenergeticam mitochondrialem significanter reducere possit sine mutatione quantitatis mtDNA [46]. Dissociatores mitochondriales fibrosis cultura inductam et activationem HSC inhibere possunt [47] et productionem ATP mitochondrialem a quibusdam proteinis, ut proteinis dissociantibus (UCP) vel adenini nucleotidi translocasa (ANT), regulatam vel inductam reducere. Secundum genus cellulae, hoc phaenomenon cellulas ab apoptosi protegere et/vel apoptosis promovere potest [46]. Attamen, ulteriores investigationes necessariae sunt ad elucidandum munus IPA tamquam dissociatoris mitochondrialis in inactivatione cellularum haematopoieticarum primordialium.
Deinde investigavimus utrum mutationes in respiratione mitochondriali in morphologia mitochondriali in cellulis LX-2 viventibus reflectantur. Interesse est quod curatio TGF-β1 proportionem mitochondrialem a sphaerica ad intermediam mutat, cum ramificatione mitochondriali diminuta et expressione DRP1 aucta, quae est factor clavis in fissione mitochondriali [48]. Praeterea, fragmentatio mitochondrialis cum complexitate retiaculi generali coniungitur, et transitus a fusione ad fissionem critica est ad activationem cellularum haematopoieticarum primordialium (HSC), dum inhibitio fissionis mitochondrialis ad apoptosis HSC ducit [49]. Itaque, nostrae conclusiones indicant curationem TGF-β1 diminutionem complexitatis retiaculi mitochondrialis cum ramificatione diminuta inducere posse, quae frequentior est in fissione mitochondriali cum cellulis haematopoieticis primordialibus (HSC) activatis coniuncta. Praeterea, nostra data demonstraverunt IPA proportionem mitochondriorum a forma sphaerica ad intermediam mutare posse, ita expressionem OPA1 et MFN2 reducendo. Studia demonstraverunt deminutionem OPA1 diminutionem potentialis membranae mitochondrialis causare et apoptosis cellularum incitare posse [50]. MFN2 notum est fusionem et apoptosis mitochondrialis mediari [51]. Resultata obtenta suggerunt inductionem cellularum LX-2 per TGF-β1 et/vel IPA formam magnitudinemque mitochondriorum, necnon statum activationis et complexitatem retium, modulare videri.
Nostrae investigationes indicant curationem compositam TGFβ-1 et IPA mtDNA et parametros morphologicos cellularum reducere posse per expressionem mRNA genorum fibrosis, apoptosis et superviventiae conexorum in cellulis apoptosis vitantibus regulandam. Re vera, IPA gradum expressionis mRNA AKT1 et genorum fibrosis magni momenti, ut COL1A2 et MMP2, diminuit, sed gradum expressionis CASP8, quae cum apoptosi coniungitur, auxit. Nostrae investigationes demonstraverunt post curationem IPA expressionem BAX imminutam esse et expressionem mRNA subunitatum familiae TIMP1, BCL-2 et NF-κB auctam esse, quod suggerit IPA signa superviventiae in cellulis haematopoieticis primordialibus (HSCs) quae apoptosis vitant stimulare posse. Hae moleculae ut signa pro-superviventiae in cellulis haematopoieticis primordialibus activatis agere possunt, quae cum expressione aucta proteinorum anti-apoptoticorum (ut Bcl-2), expressione imminuta BAX pro-apoptotici, et interactione complexa inter TIMP et NF-κB coniungi possunt [5, 7]. IPA effectus suos per PXR exercet, et invenimus curationem compositam cum TGF-β1 et IPA gradus expressionis mRNA PXR auxisse, suppressionem activationis HSC indicans. Signatio PXR activata activationem HSC inhibere nota est et in vivo et in vitro [52, 53]. Nostrae conclusiones indicant IPA in purgatione HSC activatarum participare posse per apoptosin promovendam, fibrosin et metabolismum mitochondrialem reducendam, et signa superviventiae amplificanda, quae sunt processus typici qui phaenotypum HSC activatum in inactivatum convertunt. Alia explicatio possibilis pro potentiali mechanismo et munere IPA in apoptosi est quod mitochondria dysfunctionalia praecipue per mitophagiam (viam intrinsecam) et viam extrinsecam signalationis TNF (Tabula 1), quae directe cum via signalationis superviventiae NF-κB coniungitur (Figura Supplementaria 7). Curiose, gena locupletata IPA-relata signa pro-apoptotica et pro-superviventia in via apoptotica inducere possunt [54], quod suggerit IPA viam apoptoticam vel superviventiam inducere posse per interactionem cum his genis. Attamen, quomodo IPA apoptosis vel superviventiam inducat per activationem HSC et viae eius mechanisticae incertae manent.
IPA est metabolitus microbianus ex tryptophano alimentario per microbiotam intestinalem formatus. Studia demonstraverunt eum proprietates anti-inflammatorias, antioxidantes, et epigeneticas regulatorias in ambitu intestinali habere.[55] Studia demonstraverunt IPA functionem claustri intestinalis moderari et accentum oxidativum reducere posse, quod ad effectus physiologicos locales eius conferre potest.[56] Re vera, IPA ad organa destinata per circulationem transportatur, et cum IPA similem structuram metaboliti maioris cum tryptophano, serotonino, et derivatis indoli communicet, IPA actiones metabolicas exercet, quae fata metabolica competitiva efficiunt.[52] IPA cum metabolitis a tryptophano derivatis pro locis ligationis in enzymis vel receptoribus certare potest, vias metabolicas normales potentia perturbans. Hoc necessitatem studiorum ulteriorum de pharmacocinetica et pharmacodynamica eius illustrat ut fenestram therapeuticam eius melius intelligamus.[57] Restat videndum utrum hoc etiam in cellulis haematopoieticis primordialibus (HSCs) fieri possit.
Agnoscimus studium nostrum quasdam limitationes habere. Ut associationes cum IPA conexas specifice examinaremus, aegros diabete mellito typi 2 (T2DM) affectos exclusimus. Agnoscimus hoc latam applicationem inventorum nostrorum ad aegros diabete mellito typi 2 et morbo hepatico provecto limitare. Quamquam concentratio physiologica IPA in sero humano 1-10 μM est [11, 20], concentratio 1 mM IPA electa est secundum maximam concentrationem non toxicam [15] et maximam ratem apoptosis, nulla differentia in percentatione populationis cellularum necroticarum. Quamquam gradus supraphysiologici IPA in hoc studio adhibiti sunt, nulla consensus de dosi efficaci IPA nunc est [52]. Quamquam nostrae conclusiones significantes sunt, latior fatum metabolicum IPA area investigationis activa manet. Praeterea, nostrae conclusiones de associatione inter gradus IPA in sero et methylationem DNA transcriptionum hepaticorum non solum ex cellulis haematopoieticis primordialibus (HSCs) sed etiam ex textibus hepaticis obtentae sunt. Cellulas humanas LX-2 uti decrevimus, fretus prioribus inventis nostris ex analysi transcriptomica, quae demonstraverunt IPA cum activatione cellularum haematopoieticarum primordialium (HSC) coniunctam esse [15], et HSCs esse cellulas praecipuas in progressione fibrosis hepaticae implicatas. Iecur ex multis generibus cellularum constat, ergo alia exempla cellularum, ut systema co-culturae hepatocytorum-HSC-cellularum immunium cum activatione caspasis et fragmentatione DNA coniunctum, necnon mechanismus actionis, incluso gradu proteini, consideranda sunt ad munus IPA et interactionem eius cum aliis generibus cellularum hepaticarum studendum.