Ordinatio proteinorum in via secretoria essentialis est ad cellularum compartimentationem et homeostasis conservandam. Praeter ordinationem testa mediatam, munus lipidorum in ordinatione kinesinorum in processu translationis secretoriae est quaestio fundamentalis diuturna quae nondum soluta est. Hic, imagines tridimensionales simultaneas multicolores altae resolutionis in tempore reali perficimus ut in vivo demonstremus proteinas nuper synthesizatas glycosylphosphatidylinositolo immobilizatas cum partibus lipidicis ceramidicis longissimis congregari et in situs exitus endoplasmaticos specializatos classificari, qui differt ab eo quod proteinis transmembranaceis adhibetur. Praeterea, demonstramus longitudinem catenae ceramidi in membrana reticuli endoplasmatici magni momenti esse ad hanc selectivitatem ordinationis. Studium nostrum primam probationem directam in vivo praebet ad merces proteinorum classificandas secundum longitudinem catenae lipidorum in locos exportationis selectivos in via secretoria.
In cellulis eukaryoticis, proteina in reticulo endoplasmatico (RE) synthesizata deinde per viam secretoriam transportantur ad destinationem cellularem appropriatam (1). Praeter separationem per tunicam mediatam, diu speculatum est quaedam lipida etiam ut puncta exitus selectiva fungi posse, ea in regiones membranae specificas congregando (2-5). Attamen adhuc desunt probationes directae in vivo ad hunc possibilem mechanismum lipidorum fundatum probandum. Ut hanc quaestionem fundamentalem solveremus, in fermento studuimus quomodo proteina glycosylphosphatidylinositolo (GPI) ancorata (GPI-APs) differentialiter ex RE exportentur. GPI-APs sunt varietas proteinorum superficiei cellularis lipido connexorum (6, 7). GPI-AP est proteinum secretum ad membranas externas per partem glycolipidam (ancoram GPI) adhaerens. Ancoras GPI ut modificationes post-translationales conservativas in lumine RE accipiunt (8). Post adhaesionem, GPI-AP per apparatum Golgianum (5, 9) a reticulo endoplasmatico (RE) ad membranam plasmaticam transit. Praesentia ancorarum GPI efficit ut GPI-AP separatim a proteinis transmembranaceis secretis (inter quas aliae proteinae membranae plasmaticae) per viam secretoria transportetur (5, 9, 10). In cellulis fermenti, GPI-AP ab aliis proteinis secretis in reticulo endoplasmatico separantur, deinde in vesiculas singulares involutas a complexo proteini tegumenti II (COPII) includuntur (6, 7). Determinantes huius processus classificationis in processu exportationis RE incertae sunt, sed coniectura est hunc mechanismum lipida requirere posse, praesertim reformationem structuralem partis lipidicae ancorae GPI (5, 8). In fermento, reformatio lipidorum GPI incipit statim postquam GPI adhaesit, et in multis casibus, efficit ut ceramidum ligat cum acido pingui saturato catenae longae 26-carboniorum (C26:0) (11, 12). Ceramidum C26 est ceramidum principale a cellulis fermenti hactenus productum. In reticulo endoplasmatico synthetizatur et maxima pars eius ad apparatum Golgianum per vesiculas COPII exportatur (13). Exportatio GPI-AP in reticulum endoplasmaticum specifice requirit synthesim ceramidi continuam (14, 15), et vicissim conversio ceramidi ad ceramidum inositolis phosphatis (IPC) in apparatu Golgiano dependet a synthesi ancorae GPI (16). Studia biophysica cum membranis artificialibus demonstraverunt ceramida catenae acylicae longissimae coalescere posse ad regiones ordinatas cum proprietatibus physicis singularibus formandas (17, 18). Haec data ad hypothesim ducunt ceramidum C26 et GPI-AP cum ceramido C26 proprietatibus suis physicis uti ad coalescendum in regiones ordinatas vel regiones in ambitu lipidico membranae reticuli endoplasmatici relative confuso. Plerumque constat ex glycerolipidis brevibus et insaturatis (C16:1 et C18:1) (19, 20). Hae regiones selective in loca exitus reticuli endoplasmatici (ERES) specifica dirigentur, ubi ceramidum et GPI-AP ceramide fundatum ad Golgium in eadem vesicula COPII dedicata co-transportari possunt (5).
In hoc studio, hunc mechanismum lipidorum fundatum directe probavimus utentes microscopio confocali in tempore reali imaginandi super-resolutionis (SCLIM), quod est ars microscopiae novissima quae simul proteinas fluorescentibus signatas observare potest. Imagines tricolores et tridimensionales (3D) resolutionem et celeritatem altissimam in cellulis viventibus habent (21, 22).
Primum technologiam SCLIM adhibuimus ad ulterius definiendum quomodo GPI-AP normale cum grege ceramidico C26 ex proteinis transmembranaceis secretis post egressum ex reticulo endoplasmatico (RE) in S. cerevisiae examinatum sit. Ad classificationem RE comprobandam, systema geneticum adhibuimus quod mercem recens syntheticam directe in RE intrantem visualizare potest (7, 23). Ut mercem, GPI-AP Gas1, ceramide C26 fundatum, proteina fluorescenti viridi (GFP) signatum, et proteinam transmembranaceam secretam Mid2, proteina fluorescenti prope infrarubro (iRFP) signatam, elegimus, quae ambae membranam plasmaticam petunt (24-26). In mutante temperaturae sensibili sec31-1, hae duae merces sub promotore galactosa-inducibili et indice ERES constitutivo exprimuntur. Ad extremam temperaturam (37°C), quia mutatio sec31-1 functionem componentis tegumenti COPII Sec31 ad germinationem COPII et exportationem RE inhibendam afficit, merces recens synthetica apud RE accumulatur (23). Post refrigerationem ad temperaturam humilem (24°C), cellulae mutantes sec31-1 ex area secretoria se recuperaverunt, et nova copia synthetica accumulata ex reticulo endoplasmatico (ER) exportari coepit. Visualizatio CLIM ostendit maximam partem Gas1-GFP et Mid2-iRFP nuper synthesizatarum adhuc in ER cellularum mutantium sec31-1 post incubationem ad 37°C accumulatas esse, deinde ad 24°C per 5 minuta emissas esse (Figura 1). Cum Mid2-iRFP per totam membranam ER distribuatur, et Gas1-GFP in area membranae ER discontinua concentratum et congregatum sit, distributio eorum omnino differt (Figura 1, A ad C et Pellicula S1). Praeterea, ut in Figura 1D demonstratur, grex Gas1-GFP Mid2-iRFP non habet. Haec eventa indicant GPI-AP et proteinas transmembranales in diversas regiones membranae ER mature separatas esse. Grex Gas1-GFP iuxta est ERES specificum, proteino tegumenti COPII mCherry Sec13 notatum (Figura 1, E et F, et pellicula S1) (23).
Cellulae sec31-1 secretiones galactosa-inductas exprimunt, ceramidum catenae acyl longae (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, viridis) et proteinum transmembranale Mid2-iRFP (TMP, caeruleum) et haec notatio ERES constructiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) ad 37°C per 30 minuta incubata est, ad 24°C translata, et per SCLIM post 5 minuta depicta. (A ad C) imaginem repraesentativam 2D ​​fusam vel singularem plani ostendit (A), imaginem proiectionis 2D 10 sectionum z (B) vel imaginem 3D hemisphaerii cellularis oneris et signorum ERES (C). Scala 1μm (A et B). Unitas scalae est 0.551μm (C). Gas1-GFP in regionibus discretis ER vel gregibus detectum est, dum Mid2-iRFP detectum et per membranam ER distributum est (C). (D) Graphica intensitatem fluorescentiae relativam Gas1-GFP et Mid2-iRFP in grege Gas1-GFP secundum lineam sagittae albae (sinistra) ostendit. AU, unitas arbitraria. (E et F) imaginem tridimensionalem repraesentant quae notas "goods" et "ERES" coniungit. Greges Gas1-GFP prope ERES specificum detecti sunt. Unitas scalae est 0.551μm. (F) Sagitta alba solida gregem Gas1-GFP cum ERES associatum indicat. Parietes media et dextra imaginem tridimensionalem amplificatam coniunctam et visionem rotatam gregis Gas1-GFP selecti ostendunt.
Arcta necessitudo spatialis inter gregem Gas1-GFP et ERES specificum indicat Gas1-GFP ERES selectivum intrare posse, quod differt a selectivitate quam Mid2-iRFP ad exitum ER adhibet. Ad hanc possibilitatem considerandam, rationem ERES pro una vel duabus tantum mercibus quantificavimus (Figura 2, A ad C). Invenimus plerosque ERES (70%) unum tantum genus mercium continere. Imago inferior Figurae 2C duo exempla typica ERES cum solo Gas1-GFP (Figura 1) vel solo Mid2-iRFP (Figura 2) ostendit. Contra, circiter 20% ERES duas merces continet quae in eadem area se tegunt. Inventum est nonnullas ERES (10%) duos typos mercium continere, sed in areis manifeste diversis isolatas esse. Ergo, haec analysis statistica ostendit postquam ER exportatur, GPI-AP Gas1-GFP et merces transmembranales Mid2-iRFP in diversas ERES dividi (Figura 2D). Haec efficacia separationis cum priore analysi biochemica (6) et determinatione morphologica (7) valde congruit. Etiam observare possumus mores mercium in quarantena ERES ingredientium (Figura 2E et Pellicula S2). Figura 2E ostendit tantum parvam partem Gas1-GFP (pars 3) vel Mid2-iRFP (pars 4) ex uno latere ERES ingredi et in area discreta conclusam esse. Pars 5 Figurae 2E ostendit Gas1-GFP et Mid2-iRFP interdum in eodem ERES inveniri, sed ex diversis lateribus ingredi et in regionibus separatis concentrari quae diversas vesiculas COPII repraesentare possunt. Etiam confirmavimus separationem et classificationem observatam GPI-AP Gas1, ceramidis C26 fundati, ut ERES selectivi, specificam esse quia aliud onus secretionis transmembranalis, proteinum membranae plasmaticae Axl2 (27) cum GFP notatum, similem morem Mid2-iRFP ostendens. (Imago S1 et Pellicula S3). Axl2-GFP recens synthesizatum per membranam reticuli endoplasmatici distribuitur sicut Mid2-iRFP (Figura S1, A et B), et cum Mid2-iRFP in plerisque ERES co-locatur (Figura S1, B ad D). Parietes 1 et 2 Figurae 1. S1C duo exempla typica ERES ostendit ubi duae merces transmembranales se imbricant. In his casibus, ambae merces simul ERES intrant (Figura S1E, Pars 3 et Pellicula S3).
Cellulae sec31-1 secretiones galactosum inducibiles exprimentes, Gas1-GFP (GPI-AP, viridis) et Mid2-iRFP (TMP, caeruleum) et ERES constitutivam notationem Sec13-mCherry (ERES, purpureum), ad 37°C collocatae sunt. Post incubationem per 30 minuta ad °C, ad 24°C move ut secretio obstructa liberetur, et imaginem cum SCLIM post 20 minuta cape. (A ad C) Imagines projectionis 2D repraesentativae (A; scalae linearis, 1μm) vel imagines hemisphaerii cellularum 3D (B et C; unitas scalae, 0.456μm) oneris et 10 sectiones z cum ERES notatae. Pars inferior in (B) et pars in (C) imagines processas ostendunt ut solum res in ERES (purpureum) praesentes exhibeantur [Gas1-GFP (cinereus) et Mid2-iRFP (caeruleus clarus)]. (C) Sagitta aperta: ERES tantum unam partem oneris portat (1 ad 4). Sagitta grisea: ERES merces segregatas continet (5). Sagitta alba solida: ERES merces co-locatas continet. Infra: ERES singularis selectus solum Gas1-GFP (1) vel Mid2-iRFP (2) continet. Scala, 100 nm. (D) Quantificatio photomicrographiae descriptae in (C). Percentatio media ERES quae solum unam mercem (Gas1-GFP vel Mid2-iRFP), merces segregatas et merces imbricatas continet. In tribus experimentis independentibus, n=432 in 54 cellulis. Vectis erroris = SD. Probatio t impar bicaudata. *** P = 0.0002. (E) Imago 3D ERES selecti mercis in quarantena notatae cum (C). Gas1-GFP (viridis) (3) vel Mid2-iRFP (caerulea) (4) ERES (magenta) ab uno latere intrat et ad parvam aream intra ERES restringitur. Interdum, ambo genera mercium eandem ERES (5) ex eadem parte ingrediuntur et ad aream isolatam intra ERES circumscribuntur. Scala, 100 nm.
Deinde, hypothesim probavimus ceramidum catenae acylicae longae (C26) in membrana reticuli endogeni (RE) praesens aggregationem et ordinationem specificam Gas1 in ERES selectivos impellit. Ad hunc finem, stirpem fermenti modificatam GhLag1 usi sumus, in qua duae ceramidi synthases endogenae Lag1 et Lac1 a GhLag1 (homologo Lag1 gossypii) substitutae sunt, quod stirpem fermenti cum membrana cellulari stirpis Ceramidi breviori quam typus naturalis (Figura 3A) (28) effecit. Analysis spectrometriae massae (MS) demonstravit in stirpibus naturalis, 95% ceramidi totius esse ceramidum catenae longissimae (C26), dum in GhLag1, 85% ceramidi esse longissimae (C18 et C16), tantum 2% ceramidi esse ceramidum catenae longissimae (C26). Quamquam ceramida C18 et C16 praecipua ceramida in membrana GhLag1 hactenus detecta sunt, analysis MS etiam confirmavit ancoram GPI Gas1-GFP in stirpe GhLag1 expressam ceramidum C26 continere, quod lipidis typi naturalis comparabile est. Qualitas eadem est (Fig. 3A) (26). Ergo, hoc significat enzymum remodellans ceramidi Cwh43 valde selectivum esse pro ceramide C26, ut in Figura 26 demonstratur, praeferenter ancoram GPI ex parva quantitate ceramidi C26 in stirpe GhLag1 incorporat. S2 (29). Nihilominus, membrana cellularis GhLag1 fundamentaliter tantum ceramidum C18-C16 continet, dum Gas1-GFP adhuc ceramidum C26 habet. Hoc factum hanc stirpem instrumentum ideale facit ad problema longitudinis catenae acylicae ceramidi membranae in reticulo endoplasmatico (RE) solvendum. Munus hypotheticum classis et ordinationis. Deinde, primum facultatem Gas1-GFP C26 accumulandi in glomeribus in GhLag1 cum allele mutante temperaturae sensibili sec31-1 per microscopiam fluorescentem conventionalem investigavimus, ubi sola catena longa (C18-C16) in membrana reticuli endoplasmatici (ER) exstat (Fig. 3). Observavimus in sec31-1, maximam partem Gas1-GFP in glomeribus concentratam esse, dum Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 cum membrana ER longa (C18-C16) plerumque non glomeratum et in tota membrana ER distributum erat. Ut accurate dicam, quia glomeratio C26 ceramide fundata arcte cum specificis ERES coniuncta est (Figura 1), deinde investigavimus num hic processus etiam functionem mechanismi proteini exportationis ER implicare possit. GPI-AP systema COPII speciale ad exportationem ER utitur, quod active a reformatione structurali partis glycani ancorae GPI a Ted1 facta regulatur (30, 31). GPI-glycanum recombinans deinde a complexo receptoris transmembranalis oneri p24 agnoscitur, qui vicissim selective Lst1, quod est isoforma specifica principalis subunitatis COPII oneri ligantes Sec24, adsciscit, formans vesiculas COPII divitem in GPI-AP. Vesiculae necessariae sunt (31-33). Ergo, mutationem duplicem construximus quae deletionem harum proteinarum singularum (componentis complexus p24 Emp24, enzymi GPI-glycani reformantis Ted1 et subunitatis COPII specificae Lst1) cum stirpe mutante sec31-1 coniunxit, et eas studuimus. Num possibile est Gas1-cluster GFP formare (Figura 3)? Observavimus in sec31-1emp24Δ et sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP plerumque non clusterizatum esse et per membranam reticuli endoplasmatici distributum, ut antea in sec31-1 GhLag1 visum est, dum in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP simile sec31-1. Haec eventa indicant, praeter praesentiam ceramidi C26 in membrana reticuli endoplasmatici (ER), congregationem Gas1-GFP etiam cum complexo p24 ligari debere, nec specificam Lst1 adlectionem requirere. Deinde, possibilitatem exploravimus ut longitudo catenae ceramidi in membrana ER ligationem Gas1-GFP cum p24 moderari possit. Attamen, invenimus praesentiam ceramidi C18-C16 in membrana GPI-glycanos a complexo p24 reconstructos (Figurae S3 et S4, A et B) nec ligationem cum GPI-AP et exportationem GPI-AP afficere. COPII subtypum Lst1 adlegere (Figura S4C). Ergo, congregatio C26 a ceramide dependens interactiones proteinorum cum diversis mechanismis proteinorum exportationis ER non requirit, sed mechanismum alternativum ordinationis a longitudine lipidorum impulsum sustinet. Deinde, analyzavimus utrum longitudo catenae acylicae ceramidi in membrana ER magni momenti sit ad efficientem classificationem Gas1-GFP ut ERES selectivum. Cum Gas1 in stirpe GhLag1 cum ceramide catena brevi reticulum endoplasmaticum (ER) relinquat et membranam plasmaticam ingrediatur (Figura S5), credimus, si ordinatio longitudine catenae acylicae ceramidi moveatur, Gas1 in stirpe GhLag1 redirigi et permutari posse. Bona ERES cum eadem membrana.
(A) Membrana cellularis GhLag1 plerumque ceramidas C18-C16 breviores continet, dum ancora GPI Gas1-GFP adhuc eundem IPC C26 ac cellulae typi naturalis habet. Supra: analysis longitudinis catenae acylicae ceramidi in membrana cellulari stirpium typi naturalis (Wt) et GhLag1p per spectrometriam massae (MS). Data repraesentant percentationem ceramidi totalis. Media trium experimentorum independentium. Linea erroris = SD. Probatio t bicaudata non pareata. **** P <0.0001. Pars inferior: analysis MS longitudinis catenae acylicae IPC praesentis in ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) expressa in stirpibus typi naturalis et GhLag1p. Data repraesentant percentationem signi IPC totalis. Media quinque experimentorum independentium. Linea erroris = SD. Probatio t bicaudata non pareata. ns, non magni momenti. P = 0.9134. (B) Micrographa fluorescentiae cellularum sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ et sec31-1lst1Δ Gas1-GFP galactosa-inductum exprimentium incubatae sunt ad 37°C per 30 minuta et ad membranam ER peragenda transmissae sunt. Microscopia fluorescentiae ordinaria post 24°C. Sagitta alba: Grex Gas1-GFP ER. Sagitta aperta: Gas1-GFP non aggregata per totam membranam ER distribuitur, tinctionem anuli nuclearis ER propriam ostendens. Scalae linea, 5μm. (C) Quantificatio photomicrographae descriptae in (B). Percentatio media cellularum cum structura Gas1-GFP punctata. In tribus experimentis independentibus, n≥300 cellulae. Linea erroris = SD. Test t impar bicaudatum. **** P <0.0001.
Ad hanc quaestionem directe solvendam, visualizationem SCLIM Gas1-GFP et Mid2-iRFP in GhLag1 cum allele mutante sec31-1 temperaturae sensibili perfecimus (Figura 4 et Pellicula S4). Postquam reticulum endoplasmaticum (RE) ad 37°C retentum et deinde ad 24°C emissum est, maxima pars Gas1-GFP nuper synthesizata non per membranam RE congregata et distributa est, ut per microscopia consueta observatum est (Figura 4, A et B). Praeterea, magna pars ERES (67%) duos typos mercium in se co-locatos includit (Figura 4D). Tabulae 1 et 2 Figurae 4C duo exempla typica ERES cum Gas1-GFP et Mid2-GFP imbricatis ostendunt. Accedit quod ambo merces in eundem ERES receptae sunt (Figura 4E, tabula 3 et pellicula S4). Ergo, nostrae conclusiones indicant longitudinem catenae ceramidi acyl in membrana RE esse determinantem magni momenti aggregationis et classificationis proteinorum RE.
Cellulae Sec31-1 GhLag1 secretiones galactosa inductas exprimentes, Gas1-GFP (GPI-AP, viridis) et Mid2-iRFP (TMP, caeruleum) et Sec13-mCherry (ERES, purpureum) cum ERES constitutivo. Incubentur ad 37°C. Per 30 minuta continuatur, ad 24°C decresce ut secretiones liberentur, et post 20 minuta imaginem cum SCLIM forma. (A ad C) Imagines projectionis 2D repraesentativae (A; scalae linearis, 1μm) vel imagines hemisphaerii cellularum 3D (B et C; unitas scalae, 0.45μm) decem sectionum z, onere et ERES notatarum. Pars inferior in (B) et pars in (C) imagines processas ostendunt ut solum res in ERES (purpureum) praesentes exhibeantur [Gas1-GFP (cinereus) et Mid2-iRFP (caeruleus clarus)]. (C) Sagitta alba plena: ERES, res se invicem tegunt. Sagitta aperta: ERES unum tantum item continet. Pars inferior: ERES selecta merces superimpositas (1 et 2) in (C) notatas habet. Scala, 100 nm. (D) Quantificatio photomicrographiae in (C) descriptae. In unitatibus sec31-1 et sec31-1 GhLag1, una tantum merces (Gas1-GFP vel Mid2-iRFP) includitur, et media percentatio ERES pro merce isolata et merce superimposita. In tribus experimentis independentibus, n = 432 in 54 cellulis (sec31-1) et n = 430 in 47 cellulis (sec31-1 GhLag1). Erroris linea = SD. Probatio t impar bicaudata. *** P = 0.0002 (sec31-1) et ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imago 3D ERES selectae cum merce superimposita (3) in (C) notata. Gas1-GFP (viridis) et Mid2-iRFP (caerulea) ad ERES (purpureum) ex eadem parte accedunt et in eadem area restricta ERES manent. Scalae linea, 100 nm.
Hoc studium praebet argumenta directa *in vivo* onera proteinorum lipidorum in locos exportationis selectivos in via secretoria classificari, et ostendit momentum longitudinis catenae acylicae pro selectivitate classificationis. Usi technica microscopica potenti et recentissima, quae SCLIM appellatur, Gas1-GFP (GPI-AP membranae plasmaticae maioris cum portione lipidica ceramidis catenae acylicae (C26) longissima) recens syntheticam in fermento demonstravimus. Regiones in reticulis endoplasmaticis (RE) discretis congregatae cum specificis reticulis endoplasmaticis (ER) associantur, dum proteina transmembranacea secreta per membranam RE distribuuntur (Figura 1). Praeterea, haec duo genera mercium selective in ERES differentes ingrediuntur (Figura 2). Longitudo catenae acylicae ceramidi cellularis in membrana a C26 ad C18-C16 reducitur, grex Gas1-GFP in regionem discretam RE rumpitur, et Gas1-GFP deviatur ut RE cum proteina transmembranacea per eundem ERES relinquat (Figura 3 et Figura 3). 4).
Quamquam GPI-AP mechanismo proteinico speciali ad exitum ex reticulo endoplasmatico (ER) utitur, invenimus separationem C26 ceramide-dependentem non niti interactionibus proteinicis differentialibus quae ad specialisationem ERES ducere possint (Figurae S4 et S5). Potius, nostra inventa mechanismum classificationis alternativum confirmant, a coacervatione proteinorum lipidorum fundata et subsequenti exclusione aliarum mercium impulsum. Nostrae observationes indicant regionem Gas1-GFP vel gregem cum ERES specifico associatum carere proteino transmembranaceo secreto Mid2-iRFP, quod indicat gregem GPI-AP C26 ceramide-dependentem eorum ingressum in ERES pertinentem faciliorem facturum, et simul secretiones transmembranaceas in hunc ERES specificum ingrediuntur exclusurum (Figurae 1 et 2). Contra, praesentia ceramidorum C18-C16 in membrana ER non facit ut GPI-AP regiones vel greges formet, ergo proteinas transmembranaceas secretas in eundem ERES non excludunt vel substituunt (Figurae 3 et 4). Quapropter, proponimus ceramidum C26 separationem et classificationem impellere per facilitationem coacervationis proteinorum cum specificis ERES coniunctorum.
Quomodo haec congregatio ceramidis C26 a ceramide dependentis in aream specificam reticuli endoplasmatici (RE) efficitur? Proclivitas ceramidi membranae ad lateraliter separandum potest efficere ut GPI-AP et ceramidum C26 lipida parva et statim ordinata forment in ambitu lipidico irregulari membranae RE, glycerolipida breviora et insaturata continenti. Coetus qualitatis (17, 18). Hi parvi coetus temporales ulterius in coetus maiores, stabiliores post coniunctionem cum complexo p24 (34) coalescere possunt. Hoc congruenter demonstravimus C26 Gas1-GFP cum complexo p24 interagere debere ut coetus maiores visibiles formet (Figura 3). Complexus p24 est oligomerum heterozygotum ex quattuor diversis proteinis transmembranaceis p24 in fermento compositum (35), quod nexum multivalentem praebet, quod ad nexum transversam coetuum parvorum GPI-AP ducere potest, ita coetum stabilem maiorem generans (34). Interactio inter ectodomina proteica GPI-APs etiam ad aggregationem eorum conferre potest, ut demonstratum est per translationem earum per systema Golgianum in cellulis epithelialibus polarizatis mammalium (36). Attamen, cum ceramidum C18-C16 in membrana reticuli endoplasmatici praesens est, cum complexus p24 Gas1-GFP iungitur, magni greges separati non formabuntur. Mechanismus subiacens fortasse a proprietatibus physicis et chemicis specificis ceramidi catenae acylicae longae pendet. Studia biophysica membranarum artificialium ostendunt, quamquam et ceramida catenae acylicae longae (C24) et breviae (C18-C16) separationem phasium causare possint, sola ceramida catenae acylicae longae (C24) curvaturam magnam et flexionem pelliculae ad pelliculam reformandam promovere posse. Per mutuam referentiam (17, 37, 38). Demonstratum est helicem transmembranalem TMED2, homologi humani Emp24, selective cum sphingomyelino ceramidis C18 in lobulis cytoplasmaticis interagere (39). Simulationibus dynamicae molecularis (MD) utentes, invenimus ceramidas et C18 et C26 circa lobulos cytoplasmaticos helicis transmembranalis Emp24 accumulari, et similes praeferentias habere (Figura S6). Notandum est hoc indicare helicem transmembranalem Emp24 distributionem asymmetricam lipidorum in membrana ducere posse. Hoc est resultatum recens, in cellulis mammalium fundatum. Similes simulationes MD etiam praesentiam lipidorum aethereorum ostendunt (40). Ergo, coniecimus ceramidum C26 in duobus lobulis ER26 localiter locupletatum esse. Cum GPI-AP in lobulis luminalibus directe cum p24 multivalente ligatur et accumulatio ceramidi C26 circa p24 in lobulis cytoplasmaticis, aggregationem proteinorum et curvaturam membranae per digitos generari potest promovere (41), GPI-AP in regiones discretas iuxta ERES separari faciens, quod etiam regiones valde curvas membranae ER favet (42). Relationes priores mechanismum propositum confirmaverunt (43, 44). Ligatio multivalentis oligolectinorum, pathogenorum vel anticorporum cum glycosphingolipidis ceramidis fundatis (GSL) in membrana plasmatica magnam aggregationem GSL incitat, separationem phasium auget et deformationem et internalizationem membranae causat (44). Iwabuchi etc. (43) Inventum est, praesentibus catenis acylicis longis (C24) sed non brevibus (C16), ligandum multivalentem lactosylceramido GSL coniunctum formationem magnorum globulorum et invaginationem membranae inducere, et transductionem signi cytoplasmatis Lyn-mediatam in foliolis interdigitatam esse catenis acylicis in neutrophilis coniunctis.
In cellulis epithelialibus polarizatis mammalium, concentratio retium anti-Golgianarum (TGN) ad gradum membranae plasmaticae apicalis separationem et ordinationem GPI-AP moderatur (10, 45). Haec aggregatio oligomerizatione GPI-AP impellitur (36), sed etiam a longitudine catenae ceramidis quam in fermento invenimus pendere potest. Quamquam GPI-AP mammalium ancoram aetheream lipidicam habet, et structura eius chemica a ceramide catenae acylicae longissimae valde differt, recens studium invenit utrumque lipidum proprietates physicas et chemicas et functionem evolutione similes habere (40). Ergo, pars aetherea lipidica in cellulis mammalium similis esse potest ceramide C26 in fermento, et eius munus est cum ceramide catenae longae in membrana associari ad aggregationem et ordinationem GPI-AP promovendam. Quamquam haec possibilitas adhuc directe probanda est, priora inventa confirmant translationem ceramidi catenae acylicae longae ad corpus Golgianum non a proteinis cytoplasmaticis transferentibus fieri, sed a synthesi ancorarum GPI sicut fermentum pendere. Ergo, mechanismus evolutionarius conservativus videtur selective co-transportare ceramidum catenae acylicae longissimae et GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in eadem vesicula translationis.
In systematibus cellularum epithelialis polarizatarum fermenti et mammalium, aggregatio GPI-AP et separatio ab aliis proteinis membranae plasmaticae omnes fiunt antequam superficiem cellulae attingant. Paladino et al. (48) invenerunt in TGN cellularum epithelialis polarizatarum mammalium, congregationem GPI-AP non solum necessariam esse ad classificationem selectivam GPI-AP in membrana plasmatica apicali, sed etiam ordinationem congregationis GPI-AP et eius actionem biologicam moderari. Superficies cellularis. In fermento, hoc studium demonstravit gregem GPI-AP C26 ceramide-dependentem in reticulo endoplasmatico (ER) ordinationem gregis et actionem functionalem GPI-AP in membrana plasmatica moderari posse (24, 49). Congruenter cum hoc modello, cellulae GhLag1 allergicae sunt ad inhibitores GPI vel medicamenta quae integritatem parietis cellularis afficiunt (28), et necessitas gregum Gas1-GFP functionalium (49) ceramidi apicis proiecti in coitu cellularum fermenti indicat. Possibiles consequentiae physiologicae cellularum hLag1. Error GPI-AP. Attamen, ulterius explorare utrum ordinatio functionalis superficiei cellularis ex reticulo endoplasmatico (ER) per methodum separationis secundum longitudinem lipidorum programmata sit, materia investigationis nostrae futurae erit.
Stirpes *Saccharomyces cerevisiae* in hoc opere adhibitae in Tabula S1 enumerantur. Stirpes MMY1583 et MMY1635 SCLIM ad delineationem cellularum vivarum in cursu W303 constructae sunt. Hae stirpes Sec13-mCherry cum indice proteini fluorescentis exprimentes constructae sunt methodo in reactione concatenationis polymerasis (PCR) fundata, plasmide pFA6a ut exemplari (23). Stirps Mid2-iRFP proteino fluorescenti sub imperio promotoris GAL1 signata exprimens hoc modo constructa est. Amplificatio PCR sequentiae iRFP-KanMx ex vectore pKTiRFP-KAN (dono E. O'Shea, plasmide Addgene numerus 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificator opum investigationis (RRID): Addgene_64687) et inserta in terminum C-terminalem Mid2 endogeni. Postquam sequentia genomi Mid2-iRFP amplificata et in promotorem GAL1 inserta est, in locum Not I-Sac I plasmidis integrationis pRS306 integrata est. Plasmidum inde ortum pRGS7 cum Pst I linearizatum est ut in locum URA3 integraretur.
Genum fusionis Gas1-GFP sub imperio promotoris GAL1 in plasmide centromeri (CEN) exprimitur, quod sic constructum est. Sequentia Gas1-GFP per PCR ex plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (dono L. Popolo) amplificata est et in locum Xma I–Xho I plasmidis CEN pBEVY-GL LEU2 (dono C) clonata. Miller; plasmidis Addgene numerus 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmidum resultans pRGS6 nominatum est. Genum fusionis Axl2-GFP etiam sub imperio promotoris GAL1 vectoris pBEVY-GL LEU2 exprimitur, et eius constructio sic se habet. Sequentia Axl2-GFP ex plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) per PCR amplificata est, et in locum Bam HI-Pst I vectoris pBEVY-GL LEU2 inserta est. Plasmidum resultans pRGS12 nominatum est. Sequentia oligonucleotidorum in hoc studio adhibitorum in Tabula S2 enumeratur.
Stirpi supplementum datum est cum 0.2% adenini et 2% glucosi [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose], medio extracti fermenti divite cum proteino p (YP) (1% extracti fermenti et 2% proteini extracti (YPR)] vel 2% galactose [YP-galactose (YPG)] ut fonte carbonis, vel in medio synthetico minimali (0.15% basis nitrogenii fermenti et 0.5% ammonii sulfatis) ad supplementa aminoacida et bases idoneas ad nutritionem necessarias, et continente 2% glucosi (medium syntheticum glucosi minimale) vel 2% galactose (medium syntheticum galactose minimale) ut fonte carbonis.
Ad imagines in tempore reali acquirendas, cellulae mutantes sec31-1 temperaturae sensibiles, constructum sub promotore GAL1 exprimentes, in medio YPR ad 24°C per noctem usque ad medium phasim logarithmicam creverunt. Post inductionem in YPG ad 24°C per horam unam, cellulae in SG ad 37°C per 30 minuta incubatae sunt, deinde ad 24°C translatae ut a secretione liberarentur. Concanavalinum A ad cellulas in lamella vitrea fixandas adhibitum et per SCLIM depictum est. SCLIM est coniunctio microscopii fluorescentis inversi Olympus IX-71 et lentis olei cum apertura numerica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), scrutatoris confocalis disci rotantis celeritatis altae et rationis signi ad strepitum altae (Yokogawa Electric), spectrometris ad usum fabricati, et refrigerationis ad usum fabricatae. Intensificator imaginis systematis (Hamamatsu Photonics) systema lentium amplificantium cum amplificatione finali ×266.7 et camerae cum dispositivo copulato electrico quae electrones multiplicat (Hamamatsu Photonics) praebere potest (21). Acquisitio imaginum programmate ad usum fabricato (Yokogawa Electric) perficitur. Pro imaginibus 3D, actuatorem piezoelectricum ad usum fabricatum ad lentem obiectivam verticaliter vibrandam usi sumus, et partes opticas 100 nm inter se distantes in acervo collegimus. Imago acervi Z in data voxel 3D convertitur, et functio dispersionis puncti theoreticae pro microscopio confocali disci rotantis adhibita ad processum deconvolutionis programmate Volocity (PerkinElmer) adhibetur. Adhibito programmate Volocity ad limen automaticum pro analysi co-locationis determinandum, ERES, incluso onere, mensurata est. Analysis linearis per programmate MetaMorph (Molecular Devices) peracta est.
Ad significationem statisticisticam determinandam, programmate GraphPad Prism utere. Pro examine t Studentis bilaterali et examine communi analysis variantiae unidirectionalis (ANOVA), differentiae inter greges momentum magnum in P < 0.05 (*) habere aestimantur.
Ad microscopiam fluorescentem Gas1-GFP, cellulae phasis logarithmicae per noctem in YPD creverunt et per centrifugationem collectae, bis lavatae cum solutione salina phosphato temperata, et in glacie saltem quindecim minuta incubatae sunt, deinde sub microscopio sicut antea descriptum est apud Check (24) tractatae. Ad acquisitionem microscopium Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oleum PH3 CS) instructum lente obiectiva, filtro L5 (GFP), camera Hamamatsu et programmate Application Suite X (LAS X) adhibitum est.
Exempla cum solutione SDS tamponata ad 65°C per decem minuta denaturata sunt, deinde per electrophoresis in gel polyacrylamidis SDS (PAGE) separata sunt. Ad analysin immunoblotting, decem μl exempli per lineam imposita sunt. Anticorpus primarium: Anticorpus polyclonale leporinum anti-Gas1 dilutione 1:3000, anticorpus polyclonale leporinum anti-Emp24 dilutione 1:500, et anticorpus polyclonale leporinum anti-GFP (dono ab H. Riezman) dilutione 1:3000 adhibitum est. Anticorpus monoclonale murinum anti-Pgk1 dilutione 1:5000 adhibitum est (dono a J. de la Cruz). Anticorpus secundarium: Immunoglobulinum G (IgG) caprinum anti-leporinum cum peroxidasi armoraciae (HRP) coniugatum dilutione 1:3000 adhibitum (Pierce). Anticorpus IgG caprinum anti-murum cum HRP coniugatum dilutione 1:3000 (Pierce) adhibitum est. Zona responsus immunis per methodum chemiluminescentiae reagentis SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) observata est.
Ut in (31) descriptum est, experimentum immunopraecipitationis naturalis in fractione RE locupletata peractum est. Breviter, cellulae fermenti cum solutione TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride et mixtura inhibitorum proteasis] ad 600 nm (OD600) cum densitate optica 100 bis lavantur. Globulis vitreis fractum est, deinde reliquiae cellularum et globuli vitrei centrifugatione remoti sunt. Supernatans deinde centrifugatum est ad 17,000 g per 15 minuta ad 4°C. Globulum resuspensum est in TNE et saponinum digitalis additum est ad concentrationem finalem 1%. Suspensio incubata est per 1 horam cum rotatione ad 4°C, deinde componentes insolubiles centrifugatione ad 13,000 g ad 4°C per 60 minuta remoti sunt. Ad immunopraecipitationem Gas1-GFP, primum exemplum cum globulis agarosi vacuis (ChromoTek) ad 4°C per unam horam praeincube, deinde cum GFP-Trap_A (ChromoTek) ad 4°C per tres horas incuba. Globuli immunopraecipitati quinquies cum TNE continente 0.2% digoxigenini lavati, cum liquore SDS speciminis eluti, per SDS-PAGE separati, et per immunoblotting analysati sunt.
Ut in (31) descriptum est, determinatio coniunctionis transversalis in fractione ER locupletata peracta est. Breviter, fractio ER locupletata cum 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) incubata est. Reactio coniunctionis transversalis addendo glycinam (50 mM concentrationem finalem, 5 minuta, 20°C) extincta est.
Ut antea descriptum est (50), analysis MS ceramidi in stirpibus sylvestribus et GhLag1 peracta est. Breviter, cellulae ad phasem exponentialem (3 ad 4 unitates OD600/ml) in YPD ad 30°C creverunt, et 25×107 cellulae collectae sunt. Metabolismus earum acido trichloroacetico extinguitur. Solvente extractionis [ethanolo, aqua, aether, pyridino et 4.2 N ammonii hydroxido (15:15:5:1:0.018 v/v)] et 1.2 nmol normae internae ceramidi C17 (860517, Avanti polar lipid) utere. Reagente monomethylaminico [methanolo, aqua, n-butanolo et solutione methylamini (4:3:1:5 v/v)] utere ad hydrolysim alcalinam lenem extracti perficiendam, et deinde n-butanolo aqua saturato ad desalificandum utere. Denique extractum in solvente modi positivi [chloroformium/methanolum/aqua (2:7:1) + 5 mM ammonii acetas] resuspensum et in spectrometrum massae iniectum est. Monitoratio multi-reactionis (MRM) ad identificationem et quantificationem molecularum sphingolipidarum peracta est. Spectrometrum massae quadrupolum tertiarium TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) fonte ionum nanofluxus robotico Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ad analysin lipidorum instructum est. Energia collisionis pro singulis categoriis ceramidis optimizatur. Data MS in modo positivo obtenta sunt. Pro singulis replicatis biologicis, signum lipidicum est mediana trium mensurationum independentium.
Ut in (31) descriptum est, cellulae (800×107) Gas1-GFP exprimentes immunopraecipitationi naturali subiectae sunt. Gas1-GFP purificatum per SDS-PAGE separatum et in membranam polyvinylideni fluoridi (PVDF) translatum est. Proteinum per tinctionem PVDF nigro amido visualizatum est. Fascia Gas1-GFP a PVDF secta et quinquies methanolo et semel aqua gradus chromatographiae liquidae-MS (LC-MS) lavata est. Incubando fasciam membranae cum 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), solutione tamponis et 500μl mixturae nitridi natrii 1 M recens dissolutae ad 37°C per tres horas, fractio lipidica a Gas1-GFP liberatur et ceramidis inosini phosphatis inter glucosaminum et inositolum lysatur (51). Post hoc, membrana quater aqua LC-MS abluta, temperatura ambiente siccata, et in atmosphaera nitrogenii ad -80°C usque ad analysin conservata est. In exemplari comparationis, membrana PVDF inanis ad singula experimenta adhibita est. Lipidum ex Gas1-GFP extractum deinde per MS, ut descriptum est (50), analysatum est. Breviter, membranae PVDF GPI-lipidum continentes in 75μl solventis negativi ad formam [chloroformium/methanolum (1:2) + 5 mM ammonii acetatis] resuspensae sunt et per ionizationem electrospray (ESI)-MRM/MS analysin specierum sphingolipidarum (TSQ Vantage) transierunt. Hoc in casu, data MS in modo ionum negativorum obtenta sunt.
Ut ante dictum est, pars lipidica ancorae GPI a GPI-AP [3H]-inositolo notata separata est (16). Lipida per chromatographiam tenuem separata sunt, systemate solvente utens (55:45:10 chloroformium-methanolum-0.25% KCl) et visualizata sunt utens FLA-7000 (Fujifilm).
Cellulae Gas1-GFP (600×107) exprimentes bis liquore TNE lavatae sunt, et globulis vitreis fractae, deinde centrifugatae sunt ad reliquias cellularum et globulis vitreis removendas. Supernatans deinde centrifugatum est ad 17 000 g per horam unam ad 4°C. Pestellus in TNE lavatus est et incubatus est cum 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE continenti 0.2% saponini digitalis per horam unam ad 37°C. Post curationem enzymaticam, membrana centrifugatione remota est ad 17 000 g ad 4°C per horam unam. Ad Gas1-GFP immunopraecipitandum, supernatans cum GFP-Trap_A (ChromoTek) ad 4°C per noctem incubatum est. Gas1-GFP purificatum et per SDS-PAGE separatum caeruleo Coomassie splendido tinctum est. Fascia tinctoria Gas1-GFP a cinereo colore aqueductum circumdante abscissa est, et deinde, post alkylationem iodoacetamido et reductionem dithiothreitolo, digestio in gel trypsino peracta est. Peptida tryptica et peptida GPI-glycanis extrahenda et siccata sunt. Peptidum siccum in 20 μl aquae dissolutum est. Portio (8 μl) in LC iniecta est. Columna octadecylsilani (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter internus 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Praefectura Aichi, Iaponia) ad separanda peptida sub condicionibus gradientis specificis adhibita est. Phasis mobilis est solvens A (0.08% acidi formici) et solvens B (0.15% acidi formici in 80% acetonitrilo). Systema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Bostonia, Massachusetta) adhibitum est ad columnam cum solvente A eluendam intra 55 minuta, fluxu 50 μl min-1 per 5 minuta, deinde concentratio solventis B ad 40% aucta est. (Civitates Foederatae Americae). Eluatum continue in fontem ionum ESI introductum est, et peptida tryptica et peptida cum GPI-glycanis per LTQ Orbitrap XL (spectrometrum massae hybridum lineare ion trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific) analysata sunt. In apparatu MS, tensio fontis capillaris ad 4.5 kV constituta est, et temperatura capillaris transferentis ad 300°C conservata est. Tensio capillaris et tensio lentis tubi ad 15 V et 50 V respective constitutae sunt. Data MS in modo ion positivo obtenta sunt (resolutione 60 000; accuratione massae 10 partium per million) in ambitu massae 300/m/z cum ratione massae/oneris (m/z) 3000. Data MS/MS per laqueum ionicum in LTQ Orbitrap XL obtenta sunt [primae tres notae a quibus data pendent, dissociatio collisione inducta (CID)].
Simulationes MD peractae sunt programmate GROMACS (52) et campo virium MARTINI 2 (53-55). Deinde, instrumentum CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) adhibitum est ad construendum bistratum continentem dioleoylphosphatidylcholinum (DOPC) et Cer C18 vel DOPC et Cer C26. Topologia et coordinatae Cer C26 ex DXCE derivantur per remotionem globulorum superfluorum e cauda sphingosini. Utere processu infra descripto ad aequandum duplex stratum et illud currendum, deinde utere ultimis coordinatis systematis ad construendum systema continentem Emp24. Dominium transmembranale fermenti Emp24 (reliquiae 173 ad 193) constructum est ut α-helice utens structura moleculari instrumenti visualis MD (VMD) (58). Deinde, post remotionem lipidorum imbricatorum, proteinum grosse granulatum et in bistratum insertum est utens CHARMM GUI. Systema finale continet 1202 DOPC et 302 Cer C26 vel 1197 DOPC et 295 Cer C18 et Emp24. Systema ad concentrationem 0.150M ioniza. Quattuor replicationes independentes pro duabus compositionibus bistrati factae sunt.
Bistratum lipidicum per processum CHARMM GUI aequilibratur, qui 405 000 gradus imminuendos deinde aequilibrandos implicat, ubi restrictiones positionis gradatim reducuntur et tolluntur, et gradus temporis ab 0.005 ps ad 0.02 ps augetur. Post aequilibrationem, 6 µs cum gradu temporis 0.02 ps producit. Post insertionem Emp24, eundem processum CHARMM GUI ad systema imminuendum et aequilibrandum adhibe, deinde per 8 s in productione curre.
Omnibus systematibus, per aequilibrationem, pressio a barostato Berendsen (59) regitur, et per productionem, pressio a barostato Parrinello-Rahman (60) regitur. In omnibus casibus, pressio media est 1 bar et schema copulationis pressionis semi-isotropicum adhibetur. In aequilibratione et productione, thermostatum (61) cum recalibratione celeritatis adhibētur ad copulandam temperaturam particularum proteini, lipidorum et solventis respective. Per totam operationem, temperatura meta est 310K. Interactio non-ligans computatur generando indicem paria utens schemate Verlet cum tolerantia tamponis 0.005. Terminus Coulomb computatur utens campo reactionis et distantia abscissionis 1.1 nm. Terminus Vander Waals schema abscissionis cum distantia abscissionis 1.1 nm utitur, et schema abscissionis Verlet ad derivationem potentialem (62) adhibetur.
Adhibendo VMD, longitudo undae discriminis inter granula phosphatis DOPC vel granula ceramidi AM1 et proteinum est 0.7 nm, et numerus lipidorum quae cum proteino interagunt computatur. Secundum formulam sequentem, factorem depletionis-aumentationis (DE) computa ut in (63): Factor DE = (quantitas lipidorum totalium in proteino 0.7) in proteino 0.7 (quantitas Cer in lipidis totalibus)
Valor relatus ut media obtinetur, et virgae errorum quattuor exemplaria independentia SE repraesentant. Significatio statistica factoris DE per probationem t [(mediaDE-factor-1)/SE] computatur. Valorem P ex distributione unicauda computa.
Instrumentum GROMACS adhibitum est ad tabulam densitatis lateralis bidimensionalem systematis Emp24 continentis intra ultimas 250 ns vestigii calculandam. Ad tabulam locupletationis/depletionis ceramidi obtinendam, tabula densitatis Cer dividitur per summam tabulae Cer et DOPC, deinde dividitur per concentrationem Cer in corpore. Eadem scala tabulae colorum adhibetur.
Pro materiis supplementis ad hunc articulum, vide quaeso http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
Hic est articulus apertus et sub condicionibus Licentiae Creative Commons Attribution-Non-Commercial distributus, quae usum, distributionem et reproductionem in quolibet medio permittit, dummodo usus finalis non sit ad lucrum commercialem et praemissa sit opus originale rectum esse. Referentia.
Nota: Solum rogamus ut inscriptionem electronicam tuam praebeas, ut persona quam paginae commendas sciat te velle eam videre epistulam et eam non esse spam. Nullas inscriptiones electronicas capemus.
Haec quaestio adhibetur ad explorandum utrum sis visitator et ad prohibendam submissionem automaticam epistularum inutilium.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Linero), Sergio Lopez (Miho Argio Lopez), Miho Lopez (Sergio Lopez), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagines tridimensionales altae resolutionis in tempore reali momentum longitudinis catenae ceramidae ad separationem proteinorum in locis productionis selectivis patefaciunt.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Linero), Sergio Lopez (Miho Argio Lopez), Miho Lopez (Sergio Lopez), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagines tridimensionales altae resolutionis in tempore reali momentum longitudinis catenae ceramidae ad separationem proteinorum in locis productionis selectivis patefaciunt.
©2020 Societas Americana ad profectum Scientiae. omnia iura reservata. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et CONTRA. ISSN 2375-2548.