Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem pro CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro renovato utaris (aut modum compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut continua sustentatio praestetur, situm sine stylis et JavaScript demonstrabimus.
Insecta, dissimilia vertebratis, late putantur hormona steroidea sexualia, quae ad mares inclinantur, carere. In *Anopheles gambiae*, ecdysonum steroideum 20-hydroxyecdysonum (20E) videtur evolutum esse ad incrementum ovorum moderandum cum a feminis synthesizatur2 et ad periodum refractariam copulationis inducendam cum a maribus sexualiter transfertur3. Cum incrementum ovorum et copulatio sint notae reproductivae essentiales, intellegere quomodo culices *Anopheles* feminae haec signa hormonalia integrant, consilium novorum programmatum malariae moderandae facilius reddere potest. Hic revelamus has functiones reproductivas a steroidibus sexualibus distinctis per complexam retem enzymorum ecdysteroidea activantium/inactivantium regi. Ecdysonum oxidatum maris specificum, 3-dehydro-20E (3D20E), identificavimus, quod parentationem protegit claudendo receptivitatem sexualem feminarum post translationem sexualem et activationem per dephosphorylationem. Notandum est translationem 3D20E etiam expressionem genorum reproductivorum, quae incrementum ovorum durante infectione Plasmodium conservant, induxit, salutem feminarum infectarum curans. 20E a feminis derivatum non elicit sexualem... responsum, sed permittit individuis coeuntibus ova parere postquam kinases 20E-inhibentes inhibitae sunt. Identificatio huius hormonis steroidei insecti mari proprio et munus eius in regulando receptivitatem sexualem feminarum, fertilitatem et interactionem cum Plasmodio suggerit potentiam minuendi successum reproductivum culicum malariam transmittentium.
Casus malariae et mortes iterum augentur4 propter resistentiam insecticidarum late diffusam in culicibus Anopheles, unici vectores parasitorum malariae humanae. Biologia coitus horum culicum scopus praesertim attractivus est pro novis interventionibus malariae moderandae, quia feminae semel tantum coeunt5; hunc unum eventum coitus sterilem reddere magnum potentialem haberet ad populationes culicum in agro minuendas.
Mulieres, postquam hormona steroidea altae quantitatis a viris acceperunt, sexualiter incapaces fiunt. Studia demonstraverunt causam difficultatis in ulteriore coitu esse 20-hydroxyecdysonum (20E), hormon steroideum melius notum ut regulator cycli mutationis in stadio larvali. Facultas marium ad synthesim et translationem 20E evoluta est proprie in speciebus Anopheles quae pars subgeneris Cellia7 sunt, quod in Africa distribuitur et periculosissimos vectores malariae, incluso Anopheles gambiae, includit. Hoc imprimis notandum est quia in his speciebus feminae etiam 20E post singulas ecdysonas sanguinis producunt, et 20E cyclum oogenesis agit (vide ref. 8). Attamen, parum notum est de modo quo feminae signa ex duabus diversis fontibus ecdysoni (translatio marium et inductio sanguinis pascendi) integrant sine detrimento suae facultatis coitus. Re vera, si 20E a feminis productum intolerantiam sexualem incitat, hoc ad sterilitatem in individuis virgines lacentibus ducet, quod est habitus valde communis in his culicibus5.
Explicatio possibilis est mares *A. gambiae* ecdysonam mari propriam modificatam transferre, quae seriem signalium in tractu genitali feminarum activat, instabilitatem coitus efficiens. Attamen, quamquam vertebrata multa hormona steroidea, ut oestrogenum et androgenum (recensita in ref. 9), habeant, quod scimus, steroidea androgenice propensa in insectis nondum inventa sunt.
Propositum nostrum erat repertorium hormonum steroidum in glandula accessoria masculina (MAG) A. gambiae sexualiter maturae determinare, quaerentes possibiles steroides modificantes. Usi chromatographia liquida altae efficaciae cum spectrometria massae tandem (HPLC-MS/MS) coniuncta, potius quam methodo minus specifica antea adhibita, ecdysonam (E) et 20E in hoc textu deprehendimus, priorem conclusionem confirmantes. Tamen, exemplum dominatum est a steroidibus phosphorylatis oxidatis, congruens cum formula 3-dehydro-20E-22-phosphato (3D20E22P)12 (Figura 1). Aliae formae includunt 3-dehydro-20E (3D20E) et 20E-22-phosphatum (20E22P). Intensitas signi HPLC-MS/MS 3D20E22P duobus magnitudinibus ordinibus altior erat quam forma dephosphorylata, 3D20E, et tribus magnitudinibus ordinibus altior quam E et 20E (Figura 1). Quamquam in aliis partibus corporis et inferioribus... Tractus reproductivus (TRL; Data Extensa Fig. 1a). Ecdysteroida etiam in maribus et feminis nuper clausis (<1 die natis) analyzavimus et 3D20E et 3D20E22P tantum in MAG deprehendimus; E, 20E et 20E22P in utroque sexu praesentes erant (Data Extensa Fig. 1b). Haec data suggerunt mares adultos A. gambiae altos titulos hormonum modificantium in suis MAG producere, qui a feminis non synthesizantur.
MAG et LRT feminae (atria, vesiculae seminales, et parovarium inclusis) a maribus virginibus quattuor dierum (quattuor dierum) et feminis virginibus et copulatis (0.5, 3, et 12 hpm) dissectae sunt. Ecdysonum in his textibus per HPLC-MS/MS analysatum est (media ± sem; t-test impar, bilaterale, falsa inventione rata (FDR) correcta; NS, non significans; *P < 0.05, **P < 0.01). 3D20E: 3 horae vs. 0.5 horas, P = 0.035; 12 horae vs. 3 horas, P = 0.0015; 12 horae vs. 0.5 horas, P = 0.030. 3D20E22P: 3 horae vs. 0.5 horas, P = 0.25; 12 horae vs. 3 horas, P = ... 0.0032; 12 horae contra 0.5 horas, P = 0.015). Data ex tribus replicationibus biologicis sunt. Area apicis pro singulis ecdysoni consideratis calculata et per numerum culicum normalizata est. Ecdysonum colore hoc modo repraesentatur: E, viridis; 20E, aurantiacus; 20E22P, purpureus; 3D20E, caeruleus; 3D20E22P, roseus. Insertio scalam in axe y auget ad inferiores gradus ecdysoni ostendendos.
Ut investigaremus num 3D20E22P et 3D20E transferantur tempore coitus, LRT feminas variis temporibus post coitum dissecavimus. Quamquam ecdysonum in virginibus non inventum est, quantitates magnas 3D20E22P in LRT statim post coitum (0.5 h post coitum, hpm) observavimus, quae tempore decrescunt, dum gradus 3D20E significanter augentur (Fig. 1). Usi 3D20E chemice synthetico ut norma, determinavimus gradus huius hormonis steroidei in LRT coitus saltem 100-pliciter altiores esse quam 20E (Tabula Datorum Extensorum 1). Ergo, 3D20E22P est praecipuum ecdysonum masculinum quod ad LRT feminam tempore coitus transfertur, et eius forma dephosphorylata, 3D20E, paulo post coitum valde abundanter fit. Hoc munus grave posterioris ecdysoni in biologia feminarum post coitum suggerit.
Post novam seriem datorum RNA sequentiationis (RNA-seq) generatam (Fig. 2a), per canalem bioinformaticum ad usum constructum, ecdysone kinasem (EcK), ecdysone oxidasem (EO), et ecdysonem gen phosphatase 20E-modificatum codificantem quaesivimus. EPP) in textibus reproductivis exprimitur. Unum gen candidatum EPP et duo gena EcK potentialia (EcK1 et EcK2) identificavimus, sed bonum gen candidatum EO invenire non potuimus. Notandum est singula gena EPP in altis gradibus (percentile 98.9) in MAG Gambianis expressa esse, sed non in LRT femineis (Fig. 2b), contra expectationes nostras, cum dephosphorylatio 3D20E22P in hoc textu femineo evenerit. Ideo credimus EPP masculinum tempore coitus transferri posse. Revera, in vivo inscriptionem isotoporum stabilium adhibuimus ad proteinum femineum post coitum occultandum, enzymum per MS in atrio femineo identificatum (Fig. 2c et Tabula Supplementaria 1). Praesentia EPP in MAG et LRT femina copulata (sed non virgine) etiam confirmata est per anticorpora specifica (Fig. 2d).
a, Canalis bioinformaticus ad usum constructus ad investigandas telas reproductivas cuiusque sexus pro genis EcKs, EOs, et EPPs codificantibus. Numeri iuxta sagittas numerum candidatorum masculorum et feminarum in quolibet gradu indicant. Haec analysis unum gen EPP (EPP) et unum gen EcK (EcK1) quae in maribus exprimuntur, et unum gen EcK (EcK2) quod in utroque sexu exprimitur sed non producit gen candidatum EO, identificavit. b, Tabula caloris comparans expressionem genorum candidatorum in textis virginibus (V) et copulantibus (M) Anopheles gambiae et Anopheles albicans. Spca, fecundatio; MAGs, glandulae accessoriae in maribus; aliae corporis partes, inter quas mammae, alae, crura, corpora adiposa, et organa interna in utroque sexu, et ovaria in feminis. EcK2 valde exprimitur in MAG et atriis Gambiae, dum EPP solum in MAG invenitur. c, Analysis proteomica translocationis gregis ejaculati masculini in atria feminina ad 3, 12 et 24 hpm, ostendens 67 proteinas abundantissimas. Feminae nutritae sunt cum victu continente 15N ad omnes proteinas notandas (et occultandas). Mares non notati cum feminis notatis copulati sunt, et LRT feminae dissectae sunt ad 3, 12 et 24 hpm ad analysin proteomicam (vide Tabulam Supplementariam 1 pro indice completo proteinorum ejaculatoriorum). Insertum, EPP, Eck1 et EcK2 detectae sunt in MAG marium virginum per analysin proteomicam horum textuum. d, EPP detecta est per maculam occidentalem in MAG et LRT feminarum copulatarum, sed non in feminis virginibus vel maribus vel reliqua parte feminarum. Membranae simul cum anticorporibus anti-actino (controllo oneris) et anti-EPP exploratae sunt. Omnes mares virgines sunt. Vide Figuram Supplementarem 1 pro datis fontis geli. Examen Western blot bis cum similibus eventibus peractum est.
Actio ecdysteroidis phosphophosphatasis EPP post incubationem per HPLC-MS/MS cum 3D20E22P ex MAG isolato verificata est (Data Extensa, Figura 2a). Praeterea, cum EPP per interferentiam RNA-mediatam (RNAi) silentium reduximus, reductionem fortem in activitate phosphatasis in textibus reproductivis horum marium deprehendimus (Figura 3a), et feminae cum maribus EPP-silentiatis copulatae proportionem significanter inferiorem 3D20E dephosphorylati ostenderunt (Figura 3b) quamvis silentio genico partiali (Data Extensa, Figura 2b,c). Contra, mutationes significantes in ratione 20E22P/20E in eisdem culicibus non deprehendimus, quod suggerere potest enzymum specificum esse pro 3D20E22P (Figura 3b).
a, Activitas phosphatase imminuta in MAG causata a silentio EPP utens RNA EPP bicatenarii (dsEPP) vel RNA GFP bicatenarii (dsGFP) controlibus. Viginti greges MAG in unaquaque replicatione adhibiti sunt (P = 0.0046, t-test parium, bilaterale), punctis separatis repraesentati. b, Feminae cum maribus EPP-silenciatis copulatae proportionem significanter minorem 3D20E dephosphorylati ad 3 hpm habuerunt (P = 0.0043, t-test non parium, bilaterale), dum gradus 20E non affecti sunt (P = 0.063, non parium). (test-t, bilaterale). Data exhibentur ut media ± sem ex tribus gregibus 13, 16 et 19 feminarum singulis. c, Feminae cum maribus EPP-silenciatis copulatae significanter altiores rates re-copulationis habebant (P = 0.0002, test exactum Fisheri, bilaterale). Feminae primum copulari coactae sunt ut status copulationis suae confirmaretur; Post biduum, cum aliis maribus semen transgenicum portantibus contacta sunt, ut per detectionem quantitativam transgeni per PCR aestimarentur rates re-copulationis.d Feminae sanguine pastae cum maribus EPP-silenciatis copulatae fertilitatem significanter imminutam (P < 0.0001; test Mann-Whitney, bilaterale) et numerum ovorum leviter imminutum (P = 0.088, test Mann-Whitney, bilaterale) habuerunt, dum rates ovipariae non affectae sunt (P = 0.94, test exactum Fisher, bilaterale). In omnibus tabulis, n numerum exemplorum culicum biologice independentium repraesentat. NS, non significans. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Deinde, investigavimus utrum ecdysone dephosphorylatio magni momenti sit ad resistentiam copulationis in feminis inducendam. Praesertim, feminae cum maribus EPP-depletis copulatae iterum copulatae multo frequentia maiori (44.9%) quam feminae controles (10.4%) se iterum copulaverunt cum aliis maribus (transgenicis) expositae sunt (Fig. 3c). Etiam significantem fecunditatis diminutionem (Fig. 3d, sinistra) et levem numeri ovorum a feminis positorum diminutionem (Fig. 3d, media) observavimus, dum proportio ovorum a feminis positorum (aliud responsum in feminis per copulationem elictum) non affecta est (Fig. 3d, dextra). Data specificitate observata EPP pro 3D20E22P, haec eventa suggerunt activationem 3D20E ab EPP translato per copulationem magnum momentum habere posse in excludendo receptivitatem feminarum ad ulteriorem copulationem, quod actum antea translationi sexuali 20E adscriptum erat. Ergo, hoc hormonum mari specificum etiam fecunditatem feminarum vehementer afficit.
Deinde, actiones 20E et 3D20E in experimentis injectionis in virginibus sexualiter maturis comparavimus, 3D20E chemice synthesizatum (Fig. 4a-c) et 20E in commercio praesto utentes. Observavimus 3D20E significanter efficaciorem quam 20E fuisse in intercludendo sensu feminarum ad coitum in ambabus concentrationibus (Fig. 4d). Notandum est, dimidium gradus physiologici 3D20E in LRT (1,066 pg post injectionem vs. 2,022 pg post coitum) proportionem feminarum refractariarum induxit quae vicies altior erat quam gradus physiologicus 20E (361 pg post injectionem) 24 horis post injectionem in maxima concentratione 18 pg post coitum; Tabula Datorum Extensa 1). Hoc resultat congruit cum notione quod translatio sexualis 20E non causat periodos refractarias coitus, et porro indicat 3D20E ut factorem maiorem in relatione inter parentes et liberos confirmanda. 3D20E etiam significanter activior erat quam 20E in experimentis ovipositionis in feminis virginibus (Fig. 4e), suggerens normalem ratem ovipositionis quam observavimus post silentium partialem EPP debitam esse praesentiae activitatis 3D20E residuae adhuc productae a factoribus femininis coitu inductis.
(a,b) 3D20E chemice synthesizatum ex 20E (a) cum conversione/efficacia altissima (data exhibentur ut media ± sem ex tribus reactionibus syntheticis independentibus) (b).c, Spectrum massae (dimidium inferius) exacte congruit cum ecdysone invento in LRT feminina copulata (dimidium superius).d, Comparatum cum 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; probatio exacta Fisheri, bilateralis) et 10% ethanolo (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; probatio exacta Fisheri, bilateralis), dum 20E significanter altior erat quam testigo tantum in dosibus maioribus (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; probatio exacta Fisheri, bilateralis).e, 3D20E Iniectio rates generationis significanter maiores in feminis virginibus induxit quam in testibus cum 10% ethanolo (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; probatio exacta Fisheri, bilateralis), dum 20E cum testibus comparatus tantum in dosibus maioribus (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; probatio exacta Fisheri, bilateralis). 3D20E rates generationis significanter maiores induxit quam 20E in dosibus maioribus (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; probatio exacta Fisheri, bilateralis). In omnibus tabulis, n numerum exemplorum culicum biologice independentium repraesentat. NS, non significans. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Data ex tribus replicationibus sunt.
In studiis prioribus, determinavimus translationem sexualem hormonum steroideorum expressionem MISO (Stimulatoris Oogenesis a Copulatione Inducti 11) inducere, geni reproductivi feminini quod feminas A. gambiae ab infectione P. falciparum protegit. Sumptus sanitatis a P. falciparum, parasito malariae humanae mortifero, causati. Data momenti MISO ad aptitudinem reproductivam Anopheles in regionibus malariae endemicis, decrevimus determinare quod hormon 3D20E an 20E expressionem huius geni incitat. Invenimus, dum iniectio 20E specificius vel potentius aliquos receptores hormonum nuclearium (HR), ut HR3 et HR4, et typica proposita steroidea subsequentia, ut gena yolkogenica Vg14, 15, 16, induceret, MISO vehementius a 3D20E inductum esse (Data Extensa Fig. 3). Ita, translatio sexualis huius hormonis steroidei androgenici mechanismos inducere videtur qui feminas ab sumptibus ab infectione parasitica positis protegunt. Praeterea, 3D20E differentialiter utrumque... Isoformae receptoris E (EcR), EcR-A inducentes et EcR-B reprimentes, et alia gena coitum inducentia, inter quae HPX15, quae fertilitatem feminarum afficit, vehementius incitant. Hoc sterilitatem significantem observatam in feminis cum maribus EPP-silenciatis coeuntibus explicare potest (Data Extensa, Figura 3). Haec data existentiam viarum deorsum, quae a duobus hormonibus ecdysone praeferenter activantur, suggerunt, quae functioni sexui specificae subiacere possunt.
Deinde, functionem duorum genorum EcK, in processu nostro bioinformatico identificatorum, probavimus. Silentiatio EcK1 vel EcK2 mortalitatem significantem in maribus effecit (Data Extensa, Figura 4a), quod suggerit phosphorylationem ecdysoni, et ergo inactivationem, magni momenti esse ad supervivendum. Quia EcK2 altioribus gradibus quam EcK1 expressa est et in MAG per proteomicam detecta est (Figura 2b,c et Tabula Suppletoria 2), actionem eius ecdysteroid kinase comprobavimus incubando eam cum 20E, quod phosphorylationem 20E22P effecit (Data Extensa, Figura 2b). Cum 3D20E ut substratum uteremur, productum phosphorylatum 3D20E22P detegere non potuimus (Data Extensa, Figura 4c), quod suggerit 20E potius quam 3D20E scopum praeferendum EcK2 esse posse.
Secundum nostram analysin RNA-seq, EcK2 etiam alte expressum erat in LRT virginum feminarum, ubi post coitum inactivum est (Fig. 2b). Haec data confirmavimus et determinavimus expressionem EcK2 non affici sanguinis esu (Data Extensa Fig. 5a). Experimenta nostra initialia MS extendentes, determinavimus culmen 20E22P arcte conexum esse culmini 20E (22-26 horis post sanguinis esum; Data Extensa Fig. 5b). Silentium EcK2 in virginibus effecit triplicem augmentum in ratione relativa 20E ad 20E22P 26 horis post sanguinis esum (Data Extensa Figurae 2c et 5c), confirmans EcK2 etiam 20E in feminis phosphorylare. Notandum est virgines EcK2-depletas plenam receptivitatem sexualem servavisse (Data Extensa Fig. 5d,e), ulterius suggerens productionem feminarum 20E non inducere periodos refractarias coitus. Attamen, hae feminae habuerunt... Rationes ovipositionis significanter auctae comparatione cum testibus, cum plus quam 30% virginum ova parientibus (Data Extensa, Figura 5f). Si injectiones RNA Eck2 duplicis filamenti (dsEcK2) post sanguinis esum factae sunt, ovipositio non accidit, quo in puncto culmen 20E propter sanguinis ingestionem decreverat. In universum, haec eventa exemplar confirmant quod 20E post sanguinis suctionem productum ovipositionem inducere potest, sed tantum cum impedimentum ovipositionis (EcK2 et fortasse alii factores) per coitum intercluditur. Neque injectiones 20E neque 3D20E expressionem EcK2 in virginibus inhibuerunt (Data Extensa, Figura 5g), suggerentes alios factores inhibitionem huius kinasis mediari. Attamen, gradus 20E post sanguinis esum non sufficiebant ad molestiam coitus inducendam, sed efficaciter a titris altis 3D20E sexualiter translati incitabantur.
Nostrae investigationes perspicientiam magni momenti in mechanismos qui successum reproductivum *A. gambiae* regulant praebent. Exemplar emersit ubi mares evoluti sunt ad altas quantitates 3D20E synthetizandas, ecdysoni modificati mari specifici quod parentationem per desensibilizationem feminarum ad ulteriorem coitum confirmat. Simul, hi vectores malariae etiam systema efficax ad 3D20E in feminis activandum in responsione ad translationem sexualem EPP mari specifici evolverunt. Quantum scimus, hoc est primum exemplum systematis hormonis steroidei a mari et femina dominati functionem singularem et criticam in insectis perficientis. Functio ecdysoni mari specifica postulata est sed non definitive demonstrata. Exempli gratia, hypothesis plerumque refutata 18 est has functiones a praecursore 20E E1 perfici posse. Bene notum est in *Drosophila* monandriam excitari translatione sexuali parvorum peptidorum sexualium 19,20 quae cum neuronibus tractum reproductivum femininum per receptores peptidorum sexualium specificos innervantibus interagunt 21,22. Ulterius opus requiritur ad cascadas signalationis deorsum determinandas. a 3D20E in feminis A. gambiae moderata et ut determinaremus utrum hae cascadae inter culices et Drosophilam conservari possint.
Cum munus grave 3D20E in fertilitate et moribus femininis, quod in studio nostro invenitur, ducat, viae quae ad synthesim et activationem 3D20E ducunt novas opportunitates offerunt pro futuris strategiis coercendi culicum, ut puta generatio marium sterilium competitivorum in strategiis technologiae insectorum sterilium. Ad usum ad liberationem in natura vel ad imitandum 3D20E in ludo virginali. Functio 3D20E, quae ad mares pertinet, fortasse evoluta est cum *A. gambiae* et aliae species *Celliae* facultatem coagulandi semen suum in obturacula copulatoria acquisiverunt, cum hoc efficientem translationem magni numeri hormonum et enzymorum hormona activantium permittit. Vicissim, evolutio 3D20E, monandriam implementans, mechanismum praebet feminis (per expressionem altam MISO) ad aptitudinem reproductivam suam in regionibus altae praevalentiae malariae promovendam, quod indirecte ad transmissionem Plasmodii confert. Cum 20E feminina effectus profundos in superviventia et incremento *P. falciparum* in culicibus *Anopheles* femininis habere demonstrata sit,24 et viae hormonum steroidum masculinorum et femininorum nunc partes clavis interactionum culicum-parasitum sunt.
Stirpes *A. gambiae* G3 sub condicionibus insectorum normalibus (26-28°C, humiditas relativa 65-80%, photoperiodus lucis/tenebris 12:12 h) aluntur. Larvae cibo piscium pulverulento (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets et Tetra Pond Sticks in proportione 7:7:2) pascebantur. Culices adulti solutione dextrosi 10% et sanguine humano hebdomadario ad libitum pascebantur (componentes sanguinis studii). Culices virgines per separationem sexuum in stadio pupae post examinationem extremitatum microscopia obtenti sunt. Mares transgen DsRed portantes antea descripti sunt.
Experimenta coitus coacti secundum protocolla antea descripta peracta sunt. Pro coitu naturali, feminae virgines quattuor dierum in proportione 1:3 cum maribus virginibus sexualiter maturis per duas noctes servatae sunt. Pro experimentis in quibus mares dsEPP iniecti sunt, co-cavea cum diebus 3-4 post injectionem coincidit, cum activitas phosphatasis maxime silenta erat (Data Extensa, Figura 2b).
Textus culicum, cadavera reliqui (reliquum corpus), vel totum corpus in methanolum 100% dissecti et cum granulo vitreo (2 mm globuli vitrei, 2400 rpm, 90 sec) homogeneizati sunt. Quantitates textuum et volumina methanoli erant haec: reliquum corpus, 50 in 1000 µl; MAG, 50–100 × 80 µl; LRT feminae, 25–50 × 80 µl. Praecipitatum secundae extractioni methanoli cum eodem volumine methanoli subiectum est. Fragmenta cellularum centrifugatione remota sunt. Methanolum ex ambabus extractionibus combinatum et sub fluxu nitrogenii siccatum est, deinde in sequentibus voluminibus methanoli 80% in aqua resuspensum est: reliquum corpus, 50 µl; MAG et LRT feminae, 30 µl.
Exempla in spectrometro massae (ID-X, Thermo Fisher) instrumento LC (Vanquish, Thermo Fisher) coniuncto analysata sunt. 5 µl exempli in columnam 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) ad 25°C conservatam iniecta sunt. Phases mobiles pro LC erant A (aqua, 0.1% acidi formici) et B (acetonitrilum, 0.1% acidi formici). Gradiens LC erat ut sequitur: 5% B per 1 minutum, deinde auctus ad 100% B per 11 minuta. Post 8 minuta ad 100%, columnam ad 5% B per 4 minuta iterum aequilibra. Fluxus celeritas erat 0.3 ml min-1. Ionizatio in fonte MS per ionizationem electrospray calefactam in modis positivis et negativis perficitur.
Spectrometrum massae notitias in spatio m/z a 350 ad 680, resolutione 60 000, in modo MS pleno metitur. Notitiae MS/MS in [M + H]+ (omnibus scopis), [M - H2O + H]+ (omnibus scopis), et [M - H]- (scopis phosphorylatis) acquisitae sunt. Notitiae MS/MS ad proprietates ecdysoni scoporum, quibus nulla norma praesto erat, confirmandas adhibitae sunt. Ad ecdysteroida non destinata identificanda, notitiae MS/MS omnium cacuminum HPLC cum abundantia relativa >15% analysatae sunt. Quantifica utens curvis normis ex normis puris creatis (20E, 3D20E) ad quantitates absolutas vel dilutiones unius exempli specifici (omnibus aliis scopis) calculandas ad aequivalentiam earum cum quantitatibus in uno masculo inventis calculandam. Pro 3D20E, quantificatio peracta est utens summa adductorum sequentium: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + ... NO3]-. Data extracta et quantificata sunt per Tracefinder (versionem 4.1). Data MS/MS per Xcalibur (versionem 4.4) analysata sunt. Spectra MS E, 20E et 3D20E cum suis respectivis normis comparata sunt. 3D20E22P per derivationem cum reagente Girard analysatum est. 20E22P per rationem m/z analysatum est.
3D20E22P ex MAG purificatum est. Purificatio scala analytica peracta est utens chromatographo liquido ultra-performante (Acquity, Waters) cum detectore quadrupolo massae fundato (QDa, Acquity, Waters) sub iisdem condicionibus LC ac analysis HPLC-MS/MS. Collectio fractionum incitata est cum m/z correspondens 3D20E22P eodem tempore retentionis ac antea determinatum detecta est. Puritas compositorum extractorum deinde per HPLC-MS/MS probata est ut supra descriptum est.
RNA totalis ex 10-12 textibus reproductivis vel aliis partibus corporis (sine capite) extracta est utens reagente TRI (Thermo Fisher) secundum instructiones fabricatoris. RNA tractata est cum TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA synthesizata est utens transcriptase inversa virus leucaemiae murinae Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) secundum instructiones fabricatoris. Initiatores pro PCR quantitativa transcriptionis inversae (RT-qPCR; Tabula Datorum Extensa 2) antea publicati sunt24 vel designati utens Primer-BLAST26, praeferentia data productis magnitudinis 70-150 bp et iuncturas exon-exon complecentibus vel initiatores parium initiatorum exones separatos. Exempla cDNA ex tribus ad quattuor replicatis biologicis quater in aqua diluta sunt pro RT-qPCR. Quantificatio peracta est in reactionibus replicatis 15 µl continentibus 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), initiatores, et 5 µl cDNA diluti. Reactiones currebantur in QuantStudio 6 Pro. Systema PCR temporis realis (Thermo Fisher) et data collecta et analysata sunt per Design and Analysis (versionem 2.4.3). Ut in hoc studio demonstratum est, quantitates relativae ad gen ribosomale RpL19 (AGAP004422) normalizatae sunt, cuius expressio non significanter mutata est cum sanguine cibum [27] aut coitum [3].
Qualitas RNA examinata est utens Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliothecae Illumina paired-end paratae et currebantur apud Institutum Broad MIT et Harvard. Lectiones sequentiationis cum genoma A. gambiae (stirpe PEST, versione 4.12) utens HISAT2 (versione 2.0.5) cum parametris praedefinitis ordinatae sunt. Lectiones cum qualitate mappandi (MAPQ) punctis <30 remotae sunt utens Samtools (versione 1.3.1). Numerus lectionum ad genes mappatarum numeratus est utens htseq-count (versione 0.9.1) cum parametris praedefinitis. Numeri lectionum normalizatae calculati sunt et expressio genorum differentialis analysata est utens fasciculo DESeq2 (versione 1.28.1) in R (versione 4.0.3).
Candidati genorum ecdysonum modificantium identificati sunt primum perscrutando genomum *A. gambiae* utens algorithmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utens valoribus Parametrorum implicitis cum sequentibus sequentiis proteinorum interrogationis: ex *Bombyx mori* (Numero Accessionis NP_001038956.1), *Musca domestica* (Numeri Accessionis XP_005182020.1, XP_005175332.1 et XP_011294434.1) et *Microplitis demolitor* (Numeri Accessionis XP_008552646.1 et XP_008552645.1), EcK ex *B. mori* (Numero Accessionis NP_001036900), *Drosophila melanogaster* (Numero Accessionis NP_651202), *Apis mellifera*. *(Numerus Accessionis XP_394838) et *Acyrthosiphon pisum* (Numerus Accessionis XP_001947166); et *EPP* ex *B. mori* (Numerus Accessionis XP_001947166) NP_001177919.1 et NP_001243996.1) et *EO* ex *D. melanogaster* (Numerus Accessionis NP_572986.1) (gradus 1). Deinde, filtra ictus secundum expressionem mRNA altam (>100 fragmenta/kilobase exonum per decies centena milia lectionum mappatarum (FPKM) vel >85%) in tela reproductiva (LRT feminina vel MAG) in Gambia (gradus 2). Ad specificitatem augendam, enzyma candidata delegimus quae etiam in textu reproductivo *A. albimanus*, speciei *anopheles* quae ecdysonam neque synthesizat neque transfert durante coitu, exprimuntur. Gena candidata filtrata sunt secundum expressionem humilem (<100 FPKM vel <85 percentile) in textu reproductivo *A. albimanus* (gradus 3). Ut filtrum finale (gradus 4), gena candidata saltem unum ex sequentibus satisfacere debent: (1) post coitum significanter aucta (P < 0.05) secundum analysin genorum differentialiter expressorum et (2) in textibus non reproductivis (< 85 % vel <100 FPKM).
Methodos antea descriptas 28, 29, 30 modificavimus ad designationem isotopicam totius organismi assequendam. Breviter, *Saccharomyces cerevisiae typus II* (YSC2, Sigma) typus naturalis in basi nitrogenii fermenti (BD Difco, DF0335) continenti (pondus/volumen) 2% glucosi (G7528, Sigma), 1.7% sine aminoacidis et ammonii sulfate (medio culturae) et 5% 15N ammonii sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ut solam fontem nitrogenii examinata est. Fermentum centrifugatione recuperatum est et larvae culicum ad libitum usque ad pupationem pascebantur. Farina piscium (0.5 mg per 300 larvas) supplementum addendum est ad mortalitatem quarti stadis prohibendam. Solae feminae deinde in experimentis copulationis cum maribus non designatis adhibitae sunt ad proteoma masculinum tempore copulationis translatum analysandum.
Feminae virgines, quattuor ad sex dierum natae, cum maribus virginibus sine 15N, aetate congruentibus, coire coactae sunt. Coitus prosperus per detectionem obturaculorum coitus sub microscopio epifluorescenti comprobatus est. Ad 3, 12, et 24 hpm, atria 45-55 feminarum copulatarum in 50 µl solutionis ammonii bicarbonatis (pH 7.8) dissecta et pistillo homogeneizata sunt. Homogenatum centrifugatum est et supernatans mixtum cum 50 µl solutionis 0.1% RapiGest (186001860, Waters) in 50 mM solutionis ammonii bicarbonatis. Supernatans et globulum ex quolibet exemplo in glacie sicca subito congelatum et per noctem ad laboratorium MacCoss apud Universitatem Washingtoniensem missum est, ubi praeparatio exemplorum pro LC-MS/MS completa est. Globulum resuspende in 50 µl solutionis 0.1% RapiGest in 50 mM solutionis ammonii bicarbonatis et... Sonicare in balneo aquae. Concentratio proteini in sedimento et supernatante per experimentum BCA mensurata est, exempla reducta sunt cum 5 mM dithiothreitolo (DTT; Sigma), alkylata cum 15 mM iodoacetamido (Sigma) et incubata ad 37°C (1:0 50) per 1 horam cum proportione trypsinizationis:trypsini:substrati). RapiGest lysatus est additione 200 mM HCl, deinde incubatio ad 37°C per 45 minuta et centrifugatio ad 14,000 rpm per 10 minuta ad 4°C ad detrita removenda. Exempla lavata sunt per extractionem solidae phasis dualis modi (cartridges Oasis MCX, Waters) et resuspensa in 0.1% acido formico ad concentrationem proteini finalem 0.33 µg µl-1. Proteomata MAG non signata similiter analysata sunt a viris virginibus. Duae replicationes analyticae pro quolibet exemplo analysatae sunt. Deinde, Unum µg cuiusque analysatum est per columnam siliceam fusam 25 cm longitudinis 75 μm cum laqueo frittato Kasil1 (PQ) siliceae fusae 4 cm longitudinis, resina phasis inversae Jupiter C12 (Phenomenex) repleto, et chromatographia liquida 180 minutorum. Digesta exemplorum – MS/MS in spectrometro massae Q-Exactive HF (Thermo Fisher) cum Systemate nanoACQUITY UPLC (Waters) peracta est. Data acquisitionis relata ad data, pro singulis cursibus generata, in formam mzML conversa sunt utens Proteowizard (versione 3.0.20287) et utens Comet31 (versione 3.2) contra basem datorum FASTA continentem sequentias proteinorum ex Anopheles gambiae (VectorBase versione 54), Anopheles coluzzi. Investigatio peracta est in Mali-NIH (VectorBase versione 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Martio 2021), A. gambiae RNA-seq, et translationibus trium quadrorum contaminantium humanorum notorum. FDRs mappae peptidorum congruentes determinatae sunt utens Percolator32 (versione 3.05) cum limine 0.01, et peptida in identificationes proteinorum collecta sunt utens parsimonia proteinorum in Limelight33 (versione 2.2.0). Proteina relativa... Abundantia aestimata est utens factore abundantiae spectralis normalizzato (NSAF) qui pro singulis proteinis in singulis cursibus computatus est, ut antea descriptum est. NSAF relativa ad singulas proteinas per exempla ex duabus diversis replicationibus biologicis mediata est. Notatio 15N proteoma femininum feliciter celavit, quamquam parva quantitas proteini non notati ex virginibus notatis detegi potuit. Detectionem reductionis proteini masculini (1-5 spectra) in exemplaribus crudis femininis tantum in cursibus technicis notavimus, ubi exempla cruda post exempla masculina/copulantia currebantur, propter "translationem" HPLC. Proteina interdum inventa ut "contaminantia" ex virginibus notatis in Tabula Supplementi 1 enumerantur.
Duo peptida antigenica, QTTDRVAPAPDQQQ (intra isotypum PA) et MESDGTTPSGDSEQ (intra isotypum PA et PB) in Genscript. Duo peptida coniuncta sunt, deinde cum proteino vectore KLH coniugata et in cuniculos Neozelandenses iniecta. Cuniculi post quartam iniectionem sacrificati sunt, et IgG totalis per purificationem affinitatis isolata est. IgG ex cuniculo EPP-specificissimo ad ulteriorem maculationem occidentalem adhibita est.
Pro maculationibus occidentalibus, MAG (n = 10, ubi n numerum exemplorum culicum biologice independentium repraesentat) et LRT femina (n = 30) ex maribus virginibus quattuor dierum et feminis virginibus vel vi copulatis (<10 post coitum), liquor extractionis proteinorum (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natrii deoxycholas; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× mixtura inhibitorum proteasis (Roche)) separatim addita est. Exempla statim post dissectionem cum globulo vitreo (2 mm globuli vitrei, 2,400 rpm, 90 sec) homogeneizata sunt. Fragmenta insolubilia centrifugatione ad 20,000 g ad 4°C remota sunt. Proteina per assay Bradford (Bio-Rad) quantificata sunt. Deinde, 20 µg proteini MAG, 40 µg proteini LRT, et 20 µg proteini residui in massa addita sunt. Denaturatae et separatae sunt per 10% Bis-Tris NuPAGE utens solutione MOPS. Proteina translata sunt ad membranas polyvinylideni fluoridi utens systemate translationis iBlot2 (Thermo Fisher). Membranae bis lavatae sunt in 1× PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) et deinde obstructae in solutione obstructiva Odyssey (Li-Cor) per 1 horam ad 22°C. Membranae per noctem agitatae sunt ad 4°C cum anticorpore primario polyclonali leporino anti-EPP (1:700 in solutione obstructiva) et anticorpore primario monoclonali ratti anti-actini MAC237 (Abeam; 1:4,000). Membranae lavatae sunt cum PBS-T et deinde incubatae cum anticorporibus secundariis (asini anti-leporini 800CW et caprini anti-rattini 680LT (Li-Cor), ambo 1:20,000) in solutione obstructiva continenti 0.01% SDS et 0.2% Tween-20 per 1 horam. horam ad 22°C. Membranae PBS-T ablutae et cum scrutatore Odyssey CLx depictae sunt. Imagines collectae et in Image Studio (versione 5.2) tractatae sunt. Fascia specifica isoformae EPP-RA (82 kDa) respondens non detecta est.
Regiones codificantes EPP (ut isoforma AGAP002463-RB continentem dominium histidini phosphatasis, inquisitio dominii conservati NCBI 34) et EcK2 (AGAP002181) in plasmidum pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) clonatae sunt; Initiatores in Tabula Datorum Extensorum 2 enumerantur. Octo copulae GS4 (in tandem) ante extremitatem C-terminalem 6xHis constructi pET-21a(+)-EcK2 insertae sunt. Proteina recombinantia producta sunt utens reactione synthesis proteinorum E. coli sine cellulis NEBExpress (New England BioLabs). Proteina recombinantia purificata sunt utens columnis spinis NEBExpress Ni (New England BioLabs). Proteina moderatrix dihydrofolati reductase (DHFR) producta est utens exemplo DNA ex Kit Synthesis Proteinorum E. coli sine cellulis NEBExpress. Proteina in 50% glycerolo in PBS ad -20°C usque ad tres menses conservata sunt.
Actio phosphatase EPP et extractorum textuum mensurata est utens 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Solutio reactionis continebat 25 mM Tris, 50 mM acidum aceticum, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, et 1 mM DTT. Textus in solutione reactionis homogeneizatus est et reliquiae cellulares centrifugatione remotae sunt. Reactionem initia addendo enzymum vel extractum textuum ad solutionem reactionis continentem 2.5 mg ml-1 pNPP. Mixtura reactionis incubata est temperatura ambiente in tenebris, et quantitas pNP ex pNPP conversa quantificata est mensurando absorptionem ad 405 nm variis temporibus.
Ad actionem EcK *in vitro*, proteinum cum 0.2 mg 20E vel 3D20E in 200 µl solutionis tamponis (pH 7.5) continentis 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP et 10 mM MgCl2 per 2 horas ad 27°C incubatum est. Reactio additis 800 µl methanoli interclusa est, deinde ad -20°C per 1 horam refrigerata, tum ad 20 000 g per 10 minuta ad 4°C centrifugata. Supernatans deinde per HPLC-MS/MS analysatum est. Ad proteinas in grege testigo adhibitas calore inactivandas, proteinae in 50% glycerol in PBS per 20 minuta ad 95°C incubatae sunt.
Ad actionem EPP *in vitro*, proteinum cum 3D20E22P (aequivalente quantitati inventae in 18 paribus MAG, purificatis per HPLC-MS/MS) in 100 µl solutionis tamponis (pH 7.5) continenti 25 mM Tris, 50 mM acidum aceticum, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, et 1 mM DTT per 3 horas ad 27°C incubatum est. Reactio addito 400 µl methanoli interclusa est et ad -20°C per 1 horam refrigerata, deinde centrifugata ad 20,000 g per 10 minuta ad 4°C. Supernatans per HPLC-MS/MS analysatum est.
Fragmenta PCR pro EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) et EcK2 (556 bp) ex cDNA parato ex cadaveribus culicum acapitatibus mixti sexus amplificata sunt. Fragmentum PCR controlli eGFP (495 bp) ex pCR2.1-eGFP antea descripto amplificatum est; Initiatores PCR in Tabula Datorum Extensorum 2 enumerantur. Fragmentum PCR inter promotores T7 inversos in plasmide pL4440 insertum est. Structurae plasmidicae ex E. coli NEB 5-α competenti (New England Biolabs) recuperatae et per sequentiationem DNA ante usum verificatae sunt (vide Data Supplementaria 1 pro sequentia inserti). Initiatores promotori T7 congruentes (Tabula Datorum Extensorum 2) ad amplificandum insertum ex plasmide pL4440 fundato adhibiti sunt. Magnitudo producti PCR per electrophoresin in gel agarose confirmata est. RNA bicatenaria ex formis PCR transcripta est utens Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) et purificata est secundum instructiones fabricatoris cum modificationibus antea descriptis.
Ad iniectionem dsRNA, 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) iniecta sunt concentratione 10 ng nl-1 in thoracem marium vel feminarum adultorum (Nanoject III, Drummond) intra unum diem post eclosionem. Gradus deminutionis genorum determinati sunt in saltem tribus replicationibus biologicis per extractionem RNA, synthesim cDNA, et RT-qPCR. Ad iniectionem ecdysoni, feminis virginibus quattuor dierum vel virginibus sex dierum sanguine pastis iniecta sunt cum 0.13, 0.21, vel 0.63 µg 20E vel 3D20E (Nanoject III, Drummond) concentrationibus 1.3, 2.1, respective, secundum consilium experimentale vel 6.3 ng nl-1. Iniecta 100 nl ethanoli 10% (vol/vol) in aqua; Centum nl 3D20E22P in 10% aethanolo (aequivalens 75% quantitatis in pare MAG inventae). Culices temere in gregem iniectionis assignati sunt.
Ad experimenta pariendi, feminae trium dierum ad libitum sanguine humano pascebantur. Culices partim esculenti vel non esculenti removebantur. Pro curatione, feminae in calicibus separatis pariendi per quattuor noctes saltem 48 horas post cibum sanguinis collocabantur. Ova sub stereoscopio (Stemi 508, Zeiss) numerata sunt; pro feminis coitis, ova quae in larvas exclusa sunt fertilia existimata sunt.
Ad experimenta copulationis, feminis saltem duos dies concessum est, pro curatione ad resistentiam copulationis evolvendam, et mares aetate congruentes, typi naturalis, deinde in eandem caveam introducti sunt. Duabus noctibus post, vesiculae fecundatae a feminis dissectae sunt et DNA genomicum per congelationem-liquefactionem et sonicationem in solutione tampone continenti 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, et 25 mM NaCl (pH 8.2) liberatum est. Exempla cum Proteinase K (0.86 µg µl-1) per 15 minuta ad 55°C, deinde per 10 minuta ad 95°C incubata sunt. Praeparationes DNA genomici crudae decies dilutae sunt et detectioni qPCR sequentiarum chromosomatis Y subiectae sunt; initiatores in Tabula Datorum Extensorum 2 enumerantur. Absentia sequentiae chromosomatis Y nullam copulationem indicat.
Ad experimentum iteratae copulationis, feminae vi copulatae examinatae sunt de praesentia obturaculorum copulationis ad statum copulationis confirmandum et duos dies permissi sunt ut refractarietatem ad copulationem evolverent absentibus maribus, ut antea descriptum est 36. Mares sperma transgenicum DsRed portantes deinde in caveas feminarum introducti sunt. Duabus noctibus post, vesiculae fecundantes a feminis dissectae sunt, et DNA genomicum praeparatum est ut supra descriptum et detectioni qPCR transgeni DsRed subiectum est; initiatores in Tabula Datorum Extensorum 2 enumerantur. Absentia transgeni DsRed indicavit nullam iteratam copulationem accidisse.
3D20E synthesizatum est sicut antea descriptum est37. Breviter, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) in 10 ml aquae dissoluta sunt, deinde 30 mg platini nigri (in forma pulveris, Sigma-Aldrich) additi sunt. Lenis fluxus O2 continue in mixturam reactionis bulliebat, quae temperatura ambiente agitata est. Post 6 horas, 30 mL methanoli additi sunt ad reactionem sistendam. Mixtura centrifugata est ad particulas catalysatoris removendas. Supernatans ad siccitatem evaporatum est in vacuo temperatura ambiente. Productum reactionis siccum dissolutum est in 10% ethanolo et methanolo ad injectionem pro analysi HPLC-MS/MS. Ratio conversionis (a 20E ad 3D20E) erat circiter 97% (Fig. 4b), et spectrum MS 3D20E synthesizati congruens erat cum eo quod in feminis copulatis inventum est (Fig. 4c).
Inscriptiones singula de probationibus statisticis peractis continent. GraphPad (versio 9.0) adhibitum est ad probationem exactam Fisheri, probationem Mantel-Cox, et probationem t Studentis peragendam. Probationes Cochran-Mantel-Haenszel per scriptum R proprium (disponibile apud https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) peractae sunt. Distributio datorum pro normalitate probata est utens probatione Shapiro-Wilk cum limine significationis 0.05. Cum data probationem normalitatis non superarent, probatio Mann-Whitney peracta est. Data superviventiae analysata sunt utens probatione Mantel-Cox. Sarcina DESeq2 (versio 1.28.1) ad analysin expressionis differentialis in gradu geni RNA-seq peragendam adhibita est. Virga horizontalis in grapho medianam repraesentat. Valor significationis P = 0.05 ut limen pro omnibus probationibus adhibitus est.
Plura de consilio studii invenies in summario Relationis Investigationis Naturae huic articulo coniuncto.
Data proteomica MS in ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) per PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) cum identificatore datorum PXD032157 deposita sunt.
Series datorum RNA-seq in Bibliotheca Comprehensiva Expressionis Genicae (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sub inscriptione seriali GSE198665 deposita est.
Aliae collectiones datorum, quae per hoc studium generatae et/vel analysatae sunt, ab auctoribus correspondentibus, si rationabili petitione facta sint, obtineri possunt. Hic articulus fontem datorum praebet.
De Loof, A. Ecdysteroidea: Steroida sexualia insectorum neglecta? Masculus: Arca Nigra. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF, 20-hydroxyecdysonum et incrementum ovariorum in *Anopheles stephens*. J. *Insect Physiology*. 28, 97–109 (1982).