Acidum propionicum (PPA), medicamentum antifungale et additivum commune in victu, neuroprogressum abnormalem in muribus causare demonstratum est, cum dysbiosi gastrointestinali coniunctum, quod fortasse a dysbiosi intestinali causatur. Nexus inter expositionem PPA in victu et dysbiosis microbiotae intestinalis suggestus est, sed directe non investigatus est. Hic, mutationes in compositione microbiotae intestinalis cum PPA associatas, quae ad dysbiosis ducere possunt, investigavimus. Microbiomata intestinalia murium victu non tractato (n=9) et victu PPA ditato (n=13) pastorum sequentiata sunt utens sequentiatione metagenomica longi temporis ad differentias in compositione microbiali et viis metabolicis bacterialibus aestimandas. PPA in victu cum incremento abundantiae taxonum significantium, inter quas plures species Bacteroidum, Prevotellae, et Ruminococci, quarum membra antea in productione PPA implicata sunt, associata sunt. Microbiomata murium PPA expositorum etiam plures vias ad metabolismum lipidorum et biosynthesis hormonum steroidum pertinentes habebant. Nostrae conclusiones indicant PPA microbiotam intestinalem et vias metabolicas associatas alterare posse. Hae mutationes observatae ostendunt conservativa, quae ad consumptionem tuta classificata sunt, compositionem microbiotae intestini et, vicissim, valetudinem humanam afficere posse.
Microbioma humanum saepe "ultimum corporis organum" appellatur et munus vitale in salute humana agit (Baquero et Nombela, 2012). Praesertim, microbioma intestini propter influxum suum per totum systema et munus in multis functionibus essentialibus agnoscitur. Bacteria commensalia in intestino abundant, multas nichos oecologicos occupantes, nutrimenta utentes, et cum pathogenis potentialibus certantes (Jandhyala et al., 2015). Diversae partes bacteriales microbiotae intestini capaces sunt nutrimenta essentialia, ut vitaminas, producendi et digestionem promovendi (Rowland et al., 2018). Metabolita bacterialia etiam demonstrata sunt evolutionem textuum afficere et vias metabolicas et immunitarias augere (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Compositio microbiomae intestini humani valde varia est et a factoribus geneticis et environmentalibus, ut victu, sexu, medicamentis, et statu sanitatis, pendet (Kumbhare et al., 2019).
Victus maternus est pars critica evolutionis fetalis et neonatalis et fons putativus compositorum quae evolutionem afficere possunt (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Unum tale compositum interessante est acidum propionicum (PPA), productum acidi pinguis catenae brevis ex fermentatione bacteriali obtentum et additivum cibi (den Besten et al., 2013). PPA proprietates antibacteriales et antifungales habet et ideo ut conservans cibi et in applicationibus industrialibus ad inhibendum incrementum mucoris et bacterialis adhibetur (Wemmenhove et al., 2016). PPA effectus diversos in diversis textibus habet. In hepate, PPA effectus antiinflammatorios habet afficiendo expressionem cytokinorum in macrophagis (Kawasoe et al., 2022). Hic effectus regulator etiam in aliis cellulis immunibus observatus est, ducens ad deminutionem inflammationis (Haase et al., 2021). Attamen, effectus contrarius in cerebro observatus est. Studia priora demonstraverunt expositionem PPA mores autismi similes in muribus inducere (El-Ansary et al., 2012). Alia studia demonstraverunt PPA gliosis inducere et vias pro-inflammatorias in cerebro excitare posse (Abdelli et al., 2019). Quia PPA acidum debile est, per epithelium intestinale in sanguinem diffundere potest et sic impedimenta restrictiva, inter quae impedimentum haematoencephalicum et placenta, transire (Stinson et al., 2019), quod momentum PPA tamquam metaboliti regulatorii a bacteriis producti illustrat. Quamquam munus potentiale PPA tamquam factoris periculi pro autismo nunc investigatur, effectus eius in individuis cum autismo ultra inductionem differentiationis neuralis extendi possunt.
Symptomata gastrointestinalia, ut diarrhoea et constipatio, communia sunt in aegris cum perturbationibus neurodevelopmentalibus (Cao et al., 2021). Studia priora demonstraverunt microbioma aegrotorum cum perturbationibus spectri autismi (ASD) differre ab eo individuorum sanorum, praesentiam dysbiosis microbiotae intestinalis suggerentes (Finegold et al., 2010). Similiter, proprietates microbiomae aegrotorum cum morbis inflammatoriis intestinorum, obesitate, morbo Alzheimeriano, etc. etiam differunt ab illis individuorum sanorum (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Attamen, ad hodiernum diem, nulla nexus causalis inter microbioma intestini et morbos vel symptomata neurologica stabilita est (Yap et al., 2021), quamquam plures species bacteriales putantur munus agere in quibusdam ex his morbis. Exempli gratia, *Akkermansia*, *Bacteroides*, *Clostridium*, *Lactobacillus*, *Desulfovibrio* aliaque genera abundantiora sunt in microbiota aegrotorum autismo laborantium (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Notandum est species aliquorum horum generum gena cum productione PPA consociata possidere (Reichardt et al., 2014; Yun et Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur et Dürre, 2023). Datis proprietatibus antimicrobialibus PPA, auctus eius abundantiae utilis esse potest ad incrementum bacteriorum PPA producentium (Jacobson et al., 2018). Itaque, ambitus dives PFA mutationes in microbiota intestini, inter quas pathogena gastrointestinalia, ducere potest, quae factores potentiales ad symptomata gastrointestinalia ducentia esse possunt.
Quaestio centralis in investigatione microbiomatis est utrum differentiae in compositione microbiali causa an symptomum sint morborum subiacentium. Primum gradum ad elucidandam necessitudinem complexam inter victum, microbioma intestini, et morbos neurologicos est aestimare effectus victi in compositionem microbialem. Ad hunc finem, usi sumus sequentiatione metagenomica per lectionem longam ad comparanda microbiomata intestinalia prolis murium victum divitem vel PPA carentem pastorum. Proles eadem victus ac matres suae pasta est. Hypothesim fecimus victum divitem PPA mutationes in compositione microbiali intestini et viis functionalibus microbialibus, praesertim eas quae ad metabolismum PPA et/vel productionem PPA pertinent, effecturam esse.
Hoc studium muribus transgenicis FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) usus est, qui proteinum fluorescens viride (GFP) superexprimunt sub imperio promotoris GFAP gliae specifici, secundum normas Universitatis Floridae Centralis Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Numerus Permissionis Usus Animalium: PROTO202000002). Post ablactationem, mures singillatim in caveis cum 1-5 muribus utriusque sexus per caveam collocati sunt. Mures ad libitum vel victu purificato moderatorio (victus normatus modificatus, apertus, 16 kcal% pinguis) vel victu supplementato natrii propionati (victus normatus modificatus, apertus, 16 kcal% pinguis, continens 5,000 ppm natrii propionatis) nutriti sunt. Quantitas natrii propionatis adhibita aequivalebat 5,000 mg PFA/kg ponderis totius cibi. Haec est maxima concentratio PPA ad usum conservativum cibi probata. Ad hoc studium praeparandum, mures parentes ambabus cibis per quattuor hebdomades ante coitum et per totam graviditatem matris continuaverunt. Mures progenies [22 mures, 9 controles (6 mares, 3 feminae) et 13 PPA (4 mares, 9 feminae)] ablactati sunt et deinde eadem victu ac matris per quinque menses continuata est. Mures progenies quinque mensibus aetatis immolati sunt et faeces eorum collectae et initialiter in tubulis microcentrifugae 1.5 ml ad -20°C conservatae sunt, deinde in congelatorium ad -80°C translatae donec DNA hospitis depletum esset et acida nucleica microbica extracta sunt.
DNA hospitis secundum protocollum modificatum (Charalampous et al., 2019) remotum est. Breviter, contenta faecalia in 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) translata et congelata conservata sunt. Ad maximum 1-2 granulos faecales per extractionem tracta. Contenta faecalia deinde mechanice homogeneizata sunt, pistillo plastico intra tubum utens, ut mixtura formaretur. Exempla centrifuga ad 10,000 RCF per 5 min vel donec exempla granulata sint, deinde supernatans aspira et granulum in 250 µl 1× PBS resuspende. Adde 250 µl solutionis saponini 4.4% (TCI, numerus producti S0019) exemplo ut detergente ad membranas cellularum eukaryoticarum solvendas. Exempla leniter mixta sunt donec lenia essent et ad temperaturam ambientem per 10 min incubata sunt. Deinde, ad cellulas eukaryoticas disrumpendas, 350 μl aquae sine nucleasi specimini addita est, per 30 secunda incubata, et tum 12 μl NaCl 5 M addita sunt. Exempla deinde ad 6000 RCF per 5 minuta centrifugata sunt. Supernatans aspira et pellet in 100 μl 1X PBS resuspende. Ad DNA hospitis removendum, 100 μl solutionis HL-SAN tamponis (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml aquae sine nucleasi) et 10 μl enzymi HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202) adde. Exempla diligenter pipettando mixta et ad 37°C per 30 min cum 800 rpm in Eppendorf™ ThermoMixer C incubata sunt. Post incubationem, ad 6000 RCF per 3 min centrifugata et bis cum 800 µl et 1000 µl 1X PBS lavata. Denique, pellet in 100 µl 1X PBS resuspende.
DNA bacteriale totum separatum est utens New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Modus operandi consuetus cum apparatu provisus leviter mutatus est. Aquam sine nucleasi incuba et ad 60°C ante operationem pro elutione finali serva. Adde 10 µl Proteinase K et 3 µl RNase A singulis speciminibus. Deinde adde 100 µl Cell Lysis Buffer et leniter misce. Exempla deinde in Eppendorf™ ThermoMixer C ad 56°C et 1400 rpm per saltem 1 horam et usque ad 3 horas incubata sunt. Exempla incubata ad 12,000 RCF per 3 minuta centrifugata sunt et supernatans ex singulis speciminibus in separatum tubulum microcentrifugae 1.5 mL continentem 400 µL solutionis ligantes translatum est. Tubuli deinde vortex pulsatili per 5-10 secunda intervallis 1 secundi agitati sunt. Totum liquorem cuiusque exempli (circiter 600–700 µL) in cartuchos filtrantes in tubo collectionis perfluente positos transfer. Tubi ad 1000 RCF per 3 minuta centrifugati sunt ut initialis ligatio DNA permitteretur, deinde ad 12000 RCF per 1 minutum centrifugati sunt ut liquor residuus removeretur. Columna exempli in novum tubum collectionis translata et deinde bis lavata est. Pro prima lavacro, 500 µL solutionis lavatoriae in singulos tubos adde. Tubum 3–5 vicibus inverte et deinde ad 12000 RCF per 1 minutum centrifuga. Liquorem e tubo collectionis abice et cartuchos filtrantes in eundem tubum collectionis repone. Pro secunda lavacro, 500 µL solutionis lavatoriae in filtrum sine inversione adde. Exempla ad 12000 RCF per 1 minutum centrifugata sunt. Filtrum in tubum LoBind® 1.5 mL transfer et 100 µL aquae praecalefactae sine nucleasi adde. Filtra temperatura ambiente per unum minutum incubata sunt, deinde ad 12,000 RCF per unum minutum centrifugata. DNA elutum ad -80°C conservatum est.
Concentratio DNA quantificata est utens Fluorometro Qubit™ 4.0. DNA praeparatum est utens Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Cat. No. Q33231) secundum instructiones fabricatoris. Distributio longitudinis fragmentorum DNA mensurata est utens Aglient™ 4150 vel 4200 TapeStation. DNA praeparatum est utens Agilent™ Genomic DNA Reagents (Cat. No. 5067-5366) et Genomic DNA ScreenTape (Cat. No. 5067-5365). Praeparatio bibliothecae peracta est utens Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) secundum instructiones fabricatoris. DNA sequentiatum est utens sequentiatore ONT GridION™ Mk1 cum cella fluxus Min106D (R 9.4.1). Optiones sequentiationis erant: vocatio basis altae accurationis, valor q minimus 9, configuratio codicis linearis, et decurtatio codicis linearis. Exempla per septuaginta duas horas sequentiata sunt, post quas data ex collectione basalibus ad ulteriorem processum et analysin submissa sunt.
Processus bioinformaticus per methodos antea descriptas (Greenman et al., 2024) peractus est. Fasciculi FASTQ ex sequentiatione obtenti in directoria pro singulis speciminibus divisi sunt. Ante analysin bioinformaticam, data per hanc seriem processa sunt: ​​primo, fasciculi FASTQ speciminum in unum fasciculum FASTQ coalecti sunt. Deinde, lectiones breviores quam 1000 bp per Filtlong v. 0.2.1 filtratae sunt, solo parametro mutato –min_length 1000 (Wick, 2024). Ante ulteriorem filtrationem, qualitas lectionis per NanoPlot v. 1.41.3 cum sequentibus parametris moderata est: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster et Rademakers, 2023). Lectiones cum genoma muris referentiali GRCm39 (GCF_000001635.27) ordinatae sunt utens minimap2 v. 2.24-r1122 ad tollendas lectiones contaminatas ab hospite cum sequentibus parametris: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Fasciculi ordinationis generati in formam BAM conversa sunt utens programmate `samtools view -b` (Danecek et al., 2021) in `samtools v. 1.16.1. Lectiones non ordinatae deinde identificatae sunt utens programmate `samtools view -b -f 4`, quod indicat has lectiones non pertinere ad genoma hospitis. Lectiones non ordinatae in formam FASTQ conversae sunt utens programmate `samtools bam2fq` cum parametris praedefinitis. NanoPlot iterum cucurrit in lectionibus ulterius filtratis utens optionibus antea descriptis. Post filtrationem, data metagenomica collecta sunt utens programmate `metaflye v. 2.8.2-b1689` cum parametris sequentibus: –nano-raw.–meta (Kolmogorov et al., 2020). Reliquos parametros in valoribus suis pristinis relinque. Post compositionem, lectiones filtratae ad compositionem utens minimap2 mappae sunt, et parametrus -ax map-ont adhibitus est ad fasciculum ordinationis in formato SAM generandum. Compositio primum per racon v. 1.4.20 cum sequentibus parametris refinata est: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Postquam racon completum est, ulterius per medaka v. 1.7.2, per medaka_consesus, refinatus est, omnibus parametris praeter parametrum -m in valoribus suis pristinis relictis. Parametrus -m ad r941_min_hac_g507 statuitur ad chemiam cellulae fluxus et vocationem basis altae accuratae pro nostris datis adhibitam specificandam (nanoporetech/medaka, 2024). Data filtrata (deinceps data microbica appellata) et compositionem finalem purgatam ad analysin subsequentem adhibita sunt.
Ad classificationem taxonomicam, lectiones et contigae congregatae classificatae sunt utens Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Relationes et fasciculos exitus pro lectionibus et congregationibus, respective, genera. Optionem "-use-names" ad lectiones et congregationes analyzandas utere. Optiones "-gzip-compressed" et "-paired" pro segmentis lectionum specificantur. Abundantia relativa taxonum in metagenomatibus aestimata est utens Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primo databasem kmer continentem 1000 bases creavimus utens bracken-build cum sequentibus parametris: -d.-k 35 -l 1000 Postquam constructum est, bracken currit secundum relationem a kraken2 generatam et data filtrat utens optionibus sequentibus: -d -I -O-p 1000 -l

Inter ea, P, G, vel S eligitur secundum gradum classificationis quod analysatur. Ad effectum classificationum falso positivarum minuendum, limen minimum abundantiae relativae 1e-4 (1/10,000 lectionum) adhibitum est. Ante analysin statisticisticam, abundantiae relativae a Bracken relatae (fraction_total_reads) transformatae sunt utens transformatione rationis logarithmicae centratae (CLR) (Aitchison, 1982). Methodus CLR electa est ad transformationem datorum quia est invarians scalae et sufficiens pro datorum collectionibus non sparsis (Gloor et al., 2017). Transformatio CLR utitur logarithmo naturali. Data numerationis a Bracken relata normalizata sunt utens expressione logarithmica relativa (RLE) (Anders et Huber, 2010). Figurae generatae sunt utens combinatione matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 et logarithmorum sequentialium (Gloor et al., 2017). 0.12.2 et stantanotationes v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Ratio Bacillus/Bacteroidetes pro quolibet exemplo calculata est utens numeris bacteriorum normalizatis. Valores in tabulis relati ad 4 locos decimales rotundantur. Index diversitatis Simpson calculatus est utens scripto alpha_diversity.py in fasciculo KrakenTools v. 1.2 proviso (Lu et al., 2022). Relatio Bracken in scripto praebetur et index Simpson "Si" pro parametro -an praebetur. Differentiae significantes in abundantia definitae sunt ut differentiae CLR mediae ≥ 1 vel ≤ -1. Differentia CLR media ±1 indicat augmentum 2.7-pliciter in abundantia generis exempli. Signum (+/-) indicat utrum taxon abundantior sit in exemplo PPA et exemplo moderatorio, respective. Significatio determinata est utens probatione Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Adhibitus est Statsmodels v. 0.14 (Benjamini et Hochberg, 1995; Seabold et Perktold, 2010), et methodus Benjamini-Hochberg ad corrigendum probationem multiplicem adhibita est. Valor p correctus ≤ 0.05 ut limen ad significationem statisticisticam determinandam adhibitus est.
Annotatio genorum et aestimatio abundantiae relativae peractae sunt utens versione modificata protocolli a Maranga et al. descripti (Maranga et al., 2023). Primo, contigs breviores quam 500 bp ex omnibus coetibus remoti sunt utens SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Coetus selecti deinde in pan-metagenome coniuncti sunt. Schema lectionis apertum (ORFs) identificatum est utens Prodigal v. 1.0.1 (versio parallela Prodigal v. 2.6.3) cum sequentibus parametris: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Fasciculi nucleotidorum inde resultantes deinde per Python filtrati sunt ad omnia gena imperfecta removenda. CD-HIT v. 4.8.1 deinde adhibitus est ad gena cum his parametris congreganda: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Catalogus genorum non-redundans generatus ad abundantiam et annotationem genorum aestimandam adhibitus est. Abundantia genorum relativa aestimata est utens KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018). Primum, fasciculum indicis crea utens indice KMA cum sequentibus parametribus: -i -ODeinde, indice generato una cum lectionibus microbialibus pro singulis exemplis, ut in sectione "Bioinformatics Pipeline" describitur, KMA cum sequentibus parametris currebatur: -i -O-t_db`-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24`. Deinde, numeri genorum per CLR normalizati sunt, et classis analysis principalis componentium (PCA) programmatis Sci-kit learn adhibita est (Pedregosa et al., 2011). Annotatio genorum praedicta in catalogo genorum non redundante peracta est, utens scripto emapper.py programmatis egNOG v. 2.1.12 et database egNOG versione 5.0.2 cum sequentibus parametribus: `-itype CDS` –cpu 24 -i`.– Catalogus datorum–go_evidence Non electronicum – output– Directorium egressus–orthologi_destinati omnes –valor_orthologi_seminis 0.001 –summa_orthologi_seminis 60 –tegmen_interrogationis 20 –tegmen_subiecti 0 –translate –override –directum_tempus(Cantalapiedra et al., 2021). Resultata KMA examinata sunt ad eligendas genes cum sufficiente tegumento exemplaris et identitate exemplaris (≥ 90%) et abundantia (profunditas ≥ 3). Resultata profunditatis KMA transformata sunt utens CLR sicut supra descriptum est. Resultata KMA deinde comparata sunt cum identificationibus contigum ex annotatione functionali et resultatis classificationis utens fonte contigum pro quolibet gene. Sicut cum taxonibus, differentiae significantes in abundantia genorum definitae sunt ut genes cum differentia CLR media ≥ 1 vel ≤ -1, cum signo (+/-) indicante genem abundantius fuisse in PPA vel exemplaribus moderantibus, respective.
Gena primum secundum identificatores orthologorum (KO) Encyclopaediae Genorum et Genomatum Kyotoensis (KEGG) a eggNOG assignatos digesta sunt ad abundantias viarum genicarum comparandas. Gena sine knockouts vel gena cum multis knockouts ante analysin remota sunt. Abundantia media cuiusque KO per specimen deinde calculata est et analysis statistica peracta est. Gena metabolismi PPA definita sunt ut quodlibet gen cui ordo ko00640 in columna KEGG_Pathway assignatus est, quod munus in metabolismo propionati secundum KEGG indicat. Gena identificata ut cum productione PPA associata in Tabula Supplementi 1 enumerantur (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Experimenta permutationis peracta sunt ad gena metabolismi et productionis PPA quae significanter abundantiora erant in unoquoque typo speciminis identificanda. Mille permutationes pro unoquoque gene analysatum peractae sunt. Valor p 0.05 ut limes adhibitus est ad significationem statisticam determinandam. Annotationes functionales singulis genis intra gregem assignatae sunt secundum annotationes genorum repraesentativorum intra gregem. Taxona cum metabolismo PPA et/vel productione PPA consociata identificari poterat per comparationem identificationum contigorum in fasciculis productis Kraken2 cum eisdem identificationibus contigorum retentis per annotationem functionalem utens eggNOG. Probatio significationis peracta est utens probatione Mann-Whitney U, antea descripta. Correctio pro probatione multiplici peracta est utens methodo Benjamini-Hochberg. Valor p ≤ 0.05 ut limes ad significationem statisticisticam determinandam adhibitus est.
Diversitas microbiomatis intestini murium per indicem diversitatis Simpson aestimata est. Nullae differentiae significantes inter exempla testium et exempla PPA secundum diversitatem generis et speciei observatae sunt (valor p pro genere: 0.18, valor p pro specie: 0.16) (Figura 1). Compositio microbialis deinde per analysin principalium componentium (PCA) comparata est. Figura 2 congregationem exemplorum secundum phyla ostendit, quod indicat differentias in compositione speciei microbiomatis inter exempla PPA et testium exstare. Haec congregatio minus manifesta erat ad gradum generis, quod suggerit PPA certas bacterias afficere (Figura Supplementaria 1).
Figura 1. Diversitas alpha generum et compositio specierum microbiomatis intestini muris. Diagrammata arcae ostendunt indices diversitatis Simpson generum (A) et specierum (B) in exemplaribus PPA et controlli. Significatio determinata est utens probatione Mann-Whitney U, et correctio multiplex peracta est utens methodo Benjamini-Hochberg. ns, valor p non significans erat (p>0.05).
Figura 2. Resultata analysis principalium componentium compositionis microbiomi intestini muris ad gradum speciei. Diagramma analysis principalium componentium distributionem exemplorum per primas duas componentes principales ostendit. Colores genus exempli indicant: mures PPA expositi purpurei sunt et mures controlli flavi. Componentes principales 1 et 2 in axibus x et axibus y respective depinguntur et ut ratio variantiae explicatae exprimuntur.
Adhibendo notitias numerationis per transformationem RLE, significans decrementum in mediana proportione Bacteroidetum/Bacillorum observatum est in muribus controlli et PPA (control: 9.66, PPA: 3.02; valor p = 0.0011). Haec differentia debebatur maiori abundantia Bacteroidetum in muribus PPA comparatis cum controlibus, quamquam differentia significans non erat (CLR medius controlli: 5.51, CLR medius PPA: 6.62; valor p = 0.054), dum abundantia Bacteroidetum similis erat (CLR medius controlli: 7.76, CLR medius PPA: 7.60; valor p = 0.18).
Analysis abundantiae membrorum taxonomicorum microbiomatis intestini revelavit unum phylum et 77 species inter exempla PPA et exempla comparationis significanter differre (Tabula Supplementaria 2). Abundantia 59 specierum in exemplaribus PPA significanter maior erat quam in exemplaribus comparationis, dum abundantia tantum 16 specierum in exemplaribus comparationis maior erat quam in exemplaribus PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundantia differentialis taxonum in microbioma intestini murium PPA et testium. Diagrammata "Volcano" differentias in abundantia generum (A) vel specierum (B) inter exempla PPA et testium ostendunt. Puncta cinerea nullam differentiam significantem in abundantia taxonum indicant. Puncta colorata differentias significantes in abundantia (valor p ≤ 0.05) indicant. Summa viginti taxa cum maximis differentiis in abundantia inter typos exemplorum rubro et caeruleo claro (exempla testium et PPA) colore ostenduntur, respective. Puncta flava et purpurea saltem 2.7 vicibus abundantiora erant in exemplaribus testium vel PPA quam in testibus. Puncta nigra taxa cum abundantiis significanter diversis repraesentant, cum differentiis mediis CLR inter -1 et 1. Valores P computati sunt utens probatione Mann-Whitney U et correcti sunt pro probatione multiplici utens methodo Benjamini-Hochberg. Differentiae mediae CLR crassae differentias significantes in abundantia indicant.
Postquam compositionem microbialem intestini analyzavimus, annotationem functionalem microbiomi perfecimus. Post exclusionem genorum inferioris qualitatis, summa 378 355 genorum singularium per omnia exempla identificata est. Abundantia transformata horum genorum ad analysin principalium componentium (PCA) adhibita est, et eventus altum gradum coacervationis generum exemplorum secundum perfiles functionales eorum demonstraverunt (Figura 4).
Figura 4. Resultata PCA utens profilo functionali microbiomi intestini muris. Diagramma PCA distributionem exemplorum per duas primas partes principales ostendit. Colores genus exempli indicant: mures PPA expositi purpurei sunt et mures controlli flavi. Partes principales 1 et 2 in axibus x et axibus y respective depinguntur et ut ratio variantiae explicatae exprimuntur.
Deinde abundantiam genorum KEGG "knockouts" in variis generibus exemplorum examinavimus. In summa, 3648 gena singularia "knockouts" identificata sunt, quorum 196 in exemplaribus moderantibus et 106 in exemplaribus PPA abundantiora significanter erant (Figura 5). In summa, 145 gena in exemplaribus moderantibus et 61 gena in exemplaribus PPA detecta sunt, cum abundantiis significanter diversis. Viae ad metabolismum lipidorum et aminosacchari pertinentia significanter locupletiores erant in exemplaribus PPA (Tabula Supplementaria 3). Viae ad metabolismum nitrogenii et systemata transmissionis sulfuris pertinentia significanter locupletiores erant in exemplaribus moderantibus (Tabula Supplementaria 3). Abundantia genorum ad metabolismum aminosacchari/nucleotidi pertinentium (ko:K21279) et metabolismum inositoli phosphatis (ko:K07291) significanter maior erat in exemplaribus PPA (Figura 5). Exempla moderantia significanter plura gena ad metabolismum benzoatis (ko:K22270), metabolismum nitrogenii (ko:K00368), et glycolysin/gluconeogenesin (ko:K00131) pertinentia habebant (Figura 5).
Fig. 5. Abundantia differentialis coetuum functionalium (KOs) in microbioma intestini murium PPA et murium testium. Diagramma vulcani differentias in abundantia coetuum functionalium (KOs) depingit. Puncta grisea KOs indicant quorum abundantia inter genera exemplorum non significanter differt (valor p > 0.05). Puncta colorata differentias significantes in abundantia indicant (valor p ≤ 0.05). Viginti KOs cum maximis differentiis in abundantia inter genera exemplorum rubro et caeruleo claro ostenduntur, exemplaribus testium et PPA respective respondentes. Puncta flava et purpurea KOs indicant qui saltem 2.7-plo abundantiores erant in exemplaribus testium et PPA respective. Puncta nigra KOs cum abundantiis significanter diversis indicant, cum differentiis mediis CLR inter -1 et 1. Valores P computati sunt utens probatione Mann-Whitney U et adaptati sunt ad comparationes multiplices utens methodo Benjamini-Hochberg. NaN indicat KO non pertinere ad viam in KEGG. Valores medii differentiae CLR crassi differentias significantes in abundantia indicant. Pro informatione accurata de viis quibus KO enumeratae pertinent, vide Tabulam Supplementariam 3.
Inter genes annotatas, 1601 genes abundantias inter genera exemplorum significanter diversas ostenderunt (p ≤ 0.05), quolibet gene saltem 2.7-pliciter abundantiore. Ex his genibus, 4 genes abundantiores erant in exemplaribus controlli et 1597 genes abundantiores erant in exemplaribus PPA. Quia PPA proprietates antimicrobiales habet, abundantias genum metabolismi et productionis PPA inter genera exemplorum examinavimus. Inter 1332 genes metabolismo PPA relatos, 27 genes significanter abundantiores erant in exemplaribus controlli et 12 genes abundantiores erant in exemplaribus PPA. Inter 223 genes productioni PPA relatos, 1 gen significanter abundantius erat in exemplaribus PPA. Figura 6A porro demonstrat maiorem abundantiam genum in metabolismo PPA implicatorum, cum abundantia significanter maiore in exemplaribus controlli et magnitudinibus effectuum magnis, dum Figura 6B genes singulos cum abundantia significanter maiore in exemplaribus PPA observata illustrat.
Fig. 6. Abundantia differentialis genorum PPA-relatorum in microbioma intestini muris. Diagrammata vulcani differentias in abundantia genorum cum metabolismo PPA (A) et productione PPA (B) coniunctorum depingunt. Puncta cinerea indicant gena quorum abundantia non significanter differt inter genera exemplorum (valor p > 0.05). Puncta colorata differentias significantes in abundantia indicant (valor p ≤ 0.05). Viginti gena cum maximis differentiis in abundantia rubro et caeruleo claro (exempla moderationis et PPA) respective monstrantur. Abundantia punctorum flavorum et purpureorum saltem 2.7 vicibus maior erat in exemplis moderationis et PPA quam in exemplis moderationis. Puncta nigra gena cum abundantiis significanter diversis repraesentant, cum differentiis CLR mediis inter -1 et 1. Valores P computati sunt utens probatione Mann-Whitney U et correcti sunt pro comparationibus multiplicibus utens methodo Benjamini-Hochberg. Gena respondent genis repraesentativis in catalogo genorum non-redundantium. Nomina genorum constant ex symbolo KEGG denotante gen KO. Differentiae CLR mediae litteris crassis abundantias significanter differentes indicant. Linea (-) indicat nullum symbolum pro geno in indice datorum KEGG exstare.
Taxona cum genis ad metabolismum et/vel productionem PPA pertinentibus identificata sunt per comparationem identitatis taxonomicae contigorum cum identificatione contigorum geni. In gradu generis, 130 genera gena ad metabolismum PPA pertinentia habere inventa sunt et 61 genera gena ad productionem PPA pertinentia habere inventa sunt (Tabula Supplementaria 4). Nihilominus, nulla genera differentias significantes in abundantia demonstraverunt (p > 0.05).
In gradu specierum, 144 species bacteriales genes cum metabolismo PPA consociatos habere inventae sunt, et 68 species bacteriales genes cum productione PPA consociatos habere inventae sunt (Tabula Supplementaria 5). Inter metabolizatores PPA, octo bacteria incrementa significantia in abundantia inter typos exemplorum ostenderunt, et omnes mutationes significantes in effectu ostenderunt (Tabula Supplementaria 6). Omnes metabolizatores PPA identificati cum differentiis significantibus in abundantia abundantiores erant in exemplaribus PPA. Classificatio in gradu specierum repraesentantia generum quae non significanter inter typos exemplorum differebant revelavit, inter quas plures species Bacteroidum et Ruminococcus, necnon Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, et Alcaligenes polymorpha. Inter bacteria PPA producentia, quattuor bacteria differentias significantes in abundantia inter typos exemplorum ostenderunt. Species cum differentiis significantibus in abundantia incluserunt Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, et Ruminococcus bovis.
In hoc studio, effectus expositionis PPA in microbiota intestinali murium examinavimus. PPA diversas responsiones in bacteriis elicere potest, quia a quibusdam speciebus producitur, ab aliis speciebus ut fons cibi adhibetur, vel effectus antimicrobiales habet. Ergo, additio eius ad ambitum intestinalem per supplementa alimentaria diversos effectus habere potest, secundum tolerantiam, susceptibilitatem, et facultatem eo ut fontem nutrimenti utendi. Species bacteriales sensibiles eliminari et substitui possunt ab iis quae magis resistentes sunt PPA vel possunt eo ut fontem cibi uti, quod ad mutationes in compositione microbiota intestinalis ducit. Nostrae conclusiones differentias significantes in compositione microbiali revelaverunt, sed nullum effectum in diversitatem microbialem generalem. Maximi effectus in gradu speciei observati sunt, cum plus quam 70 taxonibus significanter differentibus in abundantia inter PPA et exempla moderatoria (Tabula Supplementaria 2). Ulterior aestimatio compositionis exemplorum PPA expositorum maiorem heterogeneitatem specierum microbialium comparatarum cum exemplis non expositis revelavit, suggerens PPA posse augere proprietates accretionis bacterialis et limitare populationes bacteriales quae in ambitus PPA divites superesse possunt. Ergo, PPA mutationes selective inducere potest potius quam perturbationem latam diversitatis microbiota intestini efficere.
Conservantia ciborum, ut PPA, antea demonstrata sunt abundantiam componentium microbiomatis intestini mutare sine diversitate generali detrimento (Nagpal et al., 2021). Hic, differentias insignissimas inter species Bacteroidetum intra phylum Bacteroidetum (antea Bacteroidetes appellatas) observavimus, quae significanter locupletatae sunt in muribus PPA expositis. Abundantia aucta specierum Bacteroidetum cum degradatione muci aucta coniungitur, quae periculum infectionis augere et inflammationem promovere potest (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Una studia invenit mures mares neonatos Bacteroide fragili tractatos mores sociales perturbationem spectri autismi (ASD) similes demonstravisse (Carmel et al., 2023), et alia studia demonstraverunt species Bacteroidetum actionem immunologicam mutare et ad cardiomyopathiam inflammatoriam autoimmunem ducere posse (Gil-Cruz et al., 2019). Species ad genera *Ruminococcus*, *Prevotella*, et *Parabacteroides* pertinentes etiam significanter auctae sunt in muribus PPA expositis (Coretti et al., 2018). Quaedam species *Ruminococcus* cum morbis ut morbo Crohn per productionem cytokinorum proinflammatoriorum consociantur (Henke et al., 2019), dum species *Prevotellae*, ut *Prevotella humani*, cum morbis metabolicis ut hypertensione et sensibilitate insulini consociantur (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Denique, invenimus rationem *Bacteroidetum* (antea *Firmicutes* appellatorum) ad *Bacteroidetes* significanter inferiorem esse in muribus PPA expositis quam in muribus comparationis propter maiorem abundantiam totalem specierum *Bacteroidetum*. Haec proportio antea demonstrata est esse index magni momenti homeostasis intestinalis, et perturbationes in hac proportione cum variis morbis coniunctae sunt (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inter quos morbi inflammatorii intestinorum (Stojanov et al., 2020). Communiter, species phyli Bacteroidetum maxime affici videntur a PPA in victu elevato. Hoc fortasse debetur maiori tolerantiae ad PPA vel facultati utendi PPA ut fonte energiae, quod verum esse demonstratum est pro saltem una specie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Aliter, expositio materna ad PPA incrementum fetale augere potest reddendo intestina prolis muris magis susceptibilia colonizationi Bacteroidetum; tamen, consilium studii nostri talem aestimationem non permisit.
Aestimatio contenti metagenomici differentias significantes in abundantia genorum cum metabolismo et productione PPA consociatorum revelavit, muribus PPA expositis maiorem abundantiam genorum productionem PPA responsabilerum exhibentibus, dum muribus PPA non expositis maiorem abundantiam genorum metabolismum PAA responsabilerum exhibuerunt (Figura 6). Haec eventa suggerunt effectum PPA in compositionem microbialem non solum propter usum eius esse, alioquin abundantia genorum cum metabolismo PPA consociatorum maiorem abundantiam in microbiome intestinali murium PPA expositorum demonstrare debuisset. Una explicatio est quod PPA abundantiam bacterialem praecipue per effectus antimicrobiales potius quam per usum suum a bacteriis ut nutrimentum mediatur. Studia priora demonstraverunt PPA incrementum Salmonellae Typhimurium modo dosis dependente inhibere (Jacobson et al., 2018). Expositio ad maiores concentrationes PPA bacteria eligere potest quae proprietatibus eius antimicrobialibus resistent et non necessario eam metabolizare vel producere possunt. Exempli gratia, complures species *Parabacteroidum* abundantiam significanter maiorem in exemplaribus PPA demonstraverunt, sed nulla gena ad metabolismum vel productionem PPA pertinentia detecta sunt (Tabulae Supplementariae 2, 4, et 5). Praeterea, productio PPA ut productum secundarium fermentationis late inter varia bacteria distribuitur (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Maior diversitas bacterialis fortasse causa est maioris abundantiae genorum ad metabolismum PPA pertinentium in exemplaribus comparativis (Averina et al., 2020). Accedit quod tantum 27 (2.14%) ex 1332 genis praedicta sunt esse gena exclusive cum metabolismo PPA associata. Multa gena cum metabolismo PPA associata etiam in aliis viis metabolicis implicantur. Hoc ulterius demonstrat abundantiam genorum in metabolismo PPA implicatorum maiorem fuisse in exemplaribus comparativis; haec gena fortasse in viis funguntur quae non in utilizatione vel formatione PPA ut producti secundarii resultant. In hoc casu, tantum unum gen cum generatione PPA associatum differentias significantes in abundantia inter typos exemplorum ostendit. Contra genes cum metabolismo PPA consociatos, genes indices productionis PPA selecta sunt quia directe in via bacteriali productionis PPA implicantur. In muribus PPA expositis, omnes species abundantiam et capacitatem PPA producendi significanter auctam habere inventae sunt. Hoc praedictionem confirmat PPA productores PPA eligere et ideo praedicere capacitatem productionis PPA aucturam esse. Attamen abundantia genorum non necessario cum expressione genorum congruit; ergo, quamquam abundantia genorum cum metabolismo PPA consociatorum maior est in exemplaribus comparativis, proportio expressionis differre potest (Shi et al., 2014). Ad relationem inter praevalentiam genorum PPA producentium et productionem PPA confirmandam, studia expressionis genorum in productione PPA implicatorum necessaria sunt.
Annotatio functionalis metagenomatum PPA et moderantium aliquas differentias ostendit. Analysis PCA contenti genorum greges discretos inter exempla PPA et moderantia revelavit (Figura 5). Congregatio intra exemplum revelavit contentum genorum moderantium magis diversum esse, dum exempla PPA simul congregabantur. Congregatio secundum contentum genorum comparabilis erat cum congregatione secundum compositionem specierum. Ergo, differentiae in abundantia semitarum congruunt cum mutationibus in abundantia specierum specificarum et stirpium intra eas. In exemplaribus PPA, duae semitae cum abundantia significanter maiori cum metabolismo aminosacchari/nucleotidi sacchari (ko:K21279) et multis semitis metabolismi lipidorum (ko:K00647, ko:K03801; Tabula Supplementaria 3) relatae sunt. Gena cum ko:K21279 associata cum genere Bacteroides, uno ex generibus cum numero specierum significanter maiori in exemplaribus PPA, associata esse nota sunt. Hoc enzymum responsum immune vitare potest per expressionem polysaccharidorum capsularium (Wang et al., 2008). Hoc fortasse explicat incrementum Bacteroidetum observatum in muribus PPA expositis. Hoc auctam synthesim acidorum pinguium in microbioma PPA observatam complet. Bacteria viam FASIIko:K00647 (fabB) ad acida pinguia producenda utuntur, quae vias metabolicas hospitis afficere possunt (Yao et Rock, 2015; Johnson et al., 2020), et mutationes in metabolismo lipidorum partes agere possunt in neuroevolutione (Yu et al., 2020). Alia via abundantiam auctam in exemplaribus PPA ostendens erat biosynthesis hormonum steroidum (ko:K12343). Crescens evidentia est relationem inversam inter facultatem microbiotae intestini ad gradus hormonum afficiendos et ad ab hormonibus afficiendum, ita ut gradus steroidum elevati consequentias valetudinis habere possint (Tetel et al., 2018).
Hoc studium non caret limitibus et considerationibus. Distinctio magni momenti est nos aestimationes physiologicas animalium non perfecimus. Ergo, non licet directe concludere utrum mutationes in microbiomate cum ullo morbo coniungantur. Alia consideratio est mures in hoc studio eadem victus ratione ac matres eorum alitos esse. Studia futura fortasse determinabunt utrum transitus a victu divite PPA ad victu sine PPA eius effectus in microbiomate meliorem reddat. Una limitatio studii nostri, sicut multorum aliorum, est magnitudo exempli limitata. Quamquam conclusiones validae duci possunt, maior magnitudo exempli maiorem vim statisticisticam praeberet cum eventus analyzantur. Cauti etiam sumus de conclusionibus de associatione inter mutationes in microbiomate intestinali et ullum morbum ducendis (Yap et al., 2021). Factores confundentes, inter quos aetas, genus, et victus, compositionem microorganismorum significanter afficere possunt. Hi factores fortasse discrepantias in litteris observatas de associatione microbiomate intestinali cum morbis complexis explicant (Johnson et al., 2019; Lagod et Naser, 2023). Exempli gratia, membra generis Bacteroidetes vel aucta vel decrescere in animalibus et hominibus cum ASD demonstrata sunt (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Similiter, studia compositionis intestinorum in aegrotis morbis inflammatoriis intestinorum affectis et aucta et decrementa in eisdem taxonibus invenerunt (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Ad vim praejudicii generis limitandam, aequam repraesentationem sexuum curare conati sumus, ita ut differentiae maxime a victu impulsae essent. Una difficultas annotationis functionalis est remotio sequentiarum genorum redundantium. Nostra methodus coacervationis genorum 95% identitatem sequentiae et 85% similitudinem longitudinis, necnon 90% opertionem ordinationis requirit ad falsam coacervationem eliminandam. Attamen, in quibusdam casibus, COGs cum eisdem annotationibus (e.g., MUT) observavimus (Fig. 6). Plura studia necessaria sunt ad determinandum utrum hi orthologi distincti sint, cum generibus specificis coniuncti, an hoc sit limitatio modi genorum coacervandorum. Alia limitatio annotationis functionalis est potentialis erronea classificatio; gen bacteriale mmdA est enzymum notum quod in synthesi propionati implicatur, sed KEGG id cum via metabolica propionati non coniungit. Contra, orthologi scpB et mmcD cognati sunt. Magnus numerus genorum sine designatis knockouts potest efficere ut gena PPA-relata identificentur cum abundantia genorum aestimatur. Studia futura ex analysi metatranscriptomi proderunt, quae intellectum altiorem proprietatum functionalium microbiota intestinalis praebere et expressionem genorum cum potentialibus effectibus subsequentibus coniungere potest. Pro studiis perturbationes neurodevelopmental specificas vel morbos inflammatorios intestinorum implicantibus, aestimationes physiologicae et behaviorales animalium necessariae sunt ad mutationes in compositione microbiomatis cum his perturbationibus coniungendas. Studia addita transplantationis microbiomatis intestinalis in mures sine germinibus etiam utilia essent ad determinandum utrum microbiomatis sit impulsor vel proprietas morbi.
Summa summarum, demonstravimus PPA victuarium ut factorem agere in mutanda compositione microbiota intestinalis. PPA est conservans ab FDA approbatum, late in variis cibis inventum, quod, diuturna expositione, perturbationem florae intestinalis normalis ducere potest. Mutationes in abundantia plurium bacteriorum invenimus, quod suggerit PPA compositionem microbiota intestinalis afficere posse. Mutationes in microbiota ad mutationes in gradibus quarundam viarum metabolicarum ducere possunt, quae ad mutationes physiologicas pertinentes ad salutem hospitis perducere possunt. Studia ulteriora necessaria sunt ad determinandum utrum effectus PPA victuarii in compositionem microbialem ad dysbiosis vel alias morbos ducere possint. Hoc studium fundamentum iacit studiorum futurorum de quomodo effectus PPA in compositionem intestini salutem humanam afficere possint.
Collectiones datorum in hoc studio exhibitae in repositoriis interretialibus praesto sunt. Nomen repositorii et numerus accessionis sunt: ​​https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Hoc studium animalium a Commissione Curae et Usus Animalium Institutionalis Universitatis Floridae Centralis (UCF-IACUC) approbatum est (Numerus Permissionis Usus Animalium: PROTO202000002). Hoc studium legibus, ordinationibus, et requisitis institutionalibus localibus obtemperat.
NG: Conceptualizatio, Curatio datorum, Analysis formalis, Investigatio, Methodologia, Programmatura computatralis, Visualizatio, Scriptura (prima forma), Scriptura (recensio et emendatio). LA: Conceptualizatio, Curatio datorum, Methodologia, Opes, Scriptura (recensio et emendatio). SH: Analysis formalis, Programmatura computatralis, Scriptura (recensio et emendatio). SA: Investigatio, Scriptura (recensio et emendatio). Praefectus Iudicis: Investigatio, Scriptura (recensio et emendatio). SN: Conceptualizatio, Administratio proiecti, Opes, Supervisio, Scriptura (recensio et emendatio). TA: Conceptualizatio, Administratio proiecti, Supervisio, Scriptura (recensio et emendatio).
Auctores declaraverunt se nullum auxilium pecuniarium pro investigatione, auctoritate, et/vel publicatione huius articuli accepisse.
Auctores declarant investigationem peracta esse absentibus ullis necessitudinibus commercialibus vel pecuniariis quae interpretari possent ut potentialis conflictus utilitatis. Non pertinet.
Omnes opiniones in hoc articulo expressae solae auctorum sunt nec necessario opiniones institutionum, editorum, curatorum, aut recensorum suorum reflectunt. Quaecumque producta in hoc articulo aestimata, aut quaecumque assertiones a fabricatoribus eorum factae, ab editore non garantiuntur nec probantur.
Materia supplementaria huic articulo in interreti inveniri potest: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Acidum propionicum gliosis et neuroinflammationem inducit per moderationem semitae PTEN/AKT in perturbationibus spectri autismi. Relationes scientificae 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z.
Aitchison, J. (1982). *Analysis statistica datorum compositionis*. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Proportio Firmicutum/Bacteroidetum ut factor periculi cancri mammae. *Acta Medicinae Clinicae*, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216.
Anders S., Huber W. (2010). *Analysis differentialis expressionis datorum numerationis sequentiae*. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1.
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Microbiota faecalis et metaboloma in pueris cum autismo et perturbatione pervasiva evolutionis non aliter specificata. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993.
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Characteres neurometabolici bacteriales microbiotae intestinalis in pueris parvis cum perturbationibus spectri autismi. *Acta Microbiologiae Medicae* 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). *Microbioma ut organum humanum*. *Clinical Microbiology and Infection* 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). *Novae perspicientiae in physiologiam bacteriorum acidum propionicum producentium: Anaerotignum propionicum et Anaerotignum neopropionicum (olim *Clostridium propionicum* et *Clostridium neopropionicum*). *Microorganisms* 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685.
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Pellentesque sodales ac elit eget consequat. J Nutr. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., et Hochberg, J. (1995). *Moderatio proportionis falsorum positivorum: Modus practicus et efficax ad probationes multiplices.* JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x