Metabolita immunomodulatoria notam magni momenti microambitus tumoris (TME) constituunt, sed paucis exceptis, identitates eorum plerumque ignotae manent. Hic, tumores et cellulas T e tumoribus et ascitibus aegrotorum cum carcinomate seroso gradus alti (HGSC) analyzavimus ut metaboloma harum diversarum partium TME revelaremus. Ascites et cellulae tumoris amplas differentias inter metabolitas habent. Comparatae cum ascitibus, cellulae T tumorem infiltrantes significanter locupletantur in 1-methylnicotinamido (MNA). Quamquam gradus MNA in cellulis T elevatus est, expressio nicotinamidi N-methyltransferasis (enzymi quod translationem gregum methylicorum ab S-adenosylmethionino ad nicotinamidum catalyzat) ad fibroblastas et cellulas tumoris limitatur. Functionaliter, MNA cellulas T inducit ad secretionem cytokini tumorem promoventis, factoris necrosis tumoris alpha. Ergo, MNA ex TME derivatum ad regulationem immunologicam cellularum T confert et scopum immunotherapiae potentialem ad curationem cancri humani repraesentat.
Metabolitae e tumore derivatae magnum effectum inhibitorium in immunitatem antitumoralem habere possunt, et plura et plura indicia ostendunt eos etiam vim impulsivam progressionis morbi fungi posse (1). Praeter effectum Warburg, opera recentiora coeperunt statum metabolicum cellularum tumoris et eius relationem cum statu immunitatis microambitus tumoris (TME) describere. Studia in exemplaribus muribus et cellulis T humanis demonstraverunt metabolismum glutamini (2), metabolismum oxidativum (3) et metabolismum glucosi (4) independenter in varias subgreges cellularum immunium agere posse. Plures metabolitae in his viis functionem antitumoralem cellularum T inhibent. Demonstratum est obsidionem coenzymi tetrahydrobiopterini (BH4) proliferationem cellularum T laedere posse, et augmentum BH4 in corpore responsum immune antitumorale a CD4 et CD8 mediatum augere posse. Praeterea, effectus immunosuppressivus kynureninae per administrationem BH4 (5) servari potest. In glioblastoma mutante isocitrati dehydrogenasi (IDH), secretio enantiometabolici (R)-2-hydroxyglutarati (R-2-HG) activationem, proliferationem et actionem cytolyticam cellularum T inhibet (6). Nuper demonstratum est methylglyoxal, productum secundarium glycolysis, a cellulis suppressoribus originis myeloidis produci, et translationem methylglyoxalis a cellulis T functionem effectorum cellularum T inhibere posse. In curatione, neutralizatio methylglyoxalis actionem cellularum suppressoriarum myeloidis derivatarum (MDSC) superare et synergistice therapiam obstructionis punctorum restrictionis in exemplaribus muribus augere potest (7). Haec studia simul munus clavem metabolitorum TME derivatorum in regulatione functionis et actionis cellularum T illustrant.
Dysfunctio cellularum T late in cancro ovarii relata est (8). Hoc partim ob proprietates metabolicas hypoxiae et vasis tumoris abnormalibus inhaerentes (9) oritur, quae conversionem glucosi et tryptophani in subproducta ut acidum lacticum et kynureninum efficiunt. Lactatum extracellulare excessivum productionem interferoni-γ (IFN-γ) minuit et differentiationem subgregum myelosuppressivorum impellit (10, 11). Consumptio tryptophani directe proliferationem cellularum T inhibet et signalationem receptorum cellularum T inhibet (12-14). His observationibus non obstantibus, multum operis circa metabolismum immunitatis in cultura cellularum T in vitro peractum est, utens mediis optimisatis, vel ad exempla murina homologa in vivo limitatum, quorum neutrum heterogeneitatem cancrorum humanorum et macro et micro ambitus physiologici plene reflectit.
Communis nota cancri ovarii est propagatio peritonealis et ascitis apparitio. Accumulatio liquidi cellularis in ascitis cum morbo progresso et prognosi mala coniungitur (15). Secundum relationes, haec singularis pars hypoxica est, altos gradus factoris crescentis endothelii vascularis (VEGF) et indoleamini 2,3-dioxygenasis (IDO) habet, et a cellulis T regulatoriis et cellulis inhibitoriis myeloidibus infiltratur (15-18). Ambitus metabolicus ascitis ab eo ipsius tumoris differre potest, ita reprogrammatio cellularum T in spatio peritoneali incerta est. Praeterea, differentiae principales et heterogeneitas inter ascites et metabolitas in ambitu tumoris praesentes infiltrationem cellularum immunium et functionem earum in tumoribus impedire possunt, et ulteriores investigationes necessariae sunt.
Ad haec problemata solvenda, methodum sensibilem separationis cellularum et chromatographiae liquidae spectrometriae massae tandem (LC-MS/MS) designavimus ad investigandas varias cellularum species (inter quas cellulae T CD4+ et CD8+) necnon intra et inter tumores. Metabolitae eius cellulas in eodem ascite et ambitu tumoris aegroti pervagantur. Hanc methodum una cum cytometria fluxus altae dimensionalis et sequentiatione RNA singularis cellulae (scRNA-seq) utimur ad imaginem valde resolutam status metabolici harum populationum clavium praebendam. Haec methodus augmentum significans in gradu 1-methylnicotinamidi (MNA) in cellulis T tumoris revelavit, et experimenta in vitro demonstraverunt effectum immunomodulatorium MNA in functionem cellularum T antea ignotum fuisse. In genere, haec methodus interactiones metabolicas mutuas inter tumores et cellulas immunes revelat, et perspicientiam singularem in metabolitas regulationis immunis praebet, quae utiles esse possunt ad curationem immunotherapiae cancri ovarii fundatae in cellulis T. Opportunitates curationis.
Cytometria fluxus altae dimensionalis adhibita est ad simul quantificandam glucosi absorptionem [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucosum (2-NBDG) et actionem mitochondrialem [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) quae sunt indices typici iuxtapositi qui cellulas immunes et populationes cellularum tumoris distinguunt (Tabula S2 et Figura S1A). Haec analysis demonstravit ascites et cellulas tumoris, comparatas cum cellulis T, altiores gradus glucosi absorptionis habere, sed minores differentias in actione mitochondriali habere. Absorptio glucosi media cellularum tumoris [CD45-EpCAM (EpCAM)+] est ter vel quater maior quam cellularum T, et absorptio glucosi media cellularum T CD4+ est 1.2 maior quam cellularum T CD8+, quod indicat lymphocytos tumorem infiltrantes (TIL) necessitates metabolicas diversas habere etiam in eadem TME (Figura 1A). Contra, activitas mitochondrialis in cellulis tumoralibus similis est ei cellularum CD4+T, et activitas mitochondrialis utriusque generis cellularum altior est quam cellularum CD8+T (Figura 1B). In genere, haec eventa gradum metabolicum revelant. Activitas metabolica cellularum tumoralum altior est quam cellularum CD4+T, et activitas metabolica cellularum CD4+T altior est quam cellularum CD8+T. Quamvis his effectibus per genera cellularum, nulla differentia constans est in statu metabolico cellularum CD4+ et CD8+T vel proportionibus earum relativis in ascitibus comparatis cum tumoribus (Figura 1C). Contra, in fractione cellularum CD45, proportio cellularum EpCAM+ in tumore aucta est comparata cum ascitibus (Figura 1D). Etiam differentiam metabolicam claram inter componentes cellularum EpCAM+ et EpCAM- observavimus. Cellulae EpCAM+ (tumoralis) maiorem absorptionem glucosi et activitatem mitochondrialem habent quam cellulae EpCAM-, quae multo altior est quam activitas metabolica fibroblastarum in cellulis tumoralibus in TME (Figura 1, E et F).
(A et B) Mediana intensitas fluorescentiae (MFI) absorptionis glucosii (2-NBDG) (A) et activitas mitochondrialis cellularum T CD4+ (MitoTracker obscure rubrum) (B) Graphica repraesentativa (sinistra) et data tabulata (dextra), cellulae T CD8+ et cellulae EpCAM+ CD45-tumoris ex ascite et tumore. (C) Ratio cellularum CD4+ et CD8+ (cellularum T CD3+) in ascite et tumore. (D) Proportio cellularum tumoris EpCAM+ in ascite et tumore (CD45−). (E et F) EpCAM+ CD45-tumor et EpCAM-CD45-matrix absorptio glucosii (2-NBDG) (E) et activitas mitochondrialis (MitoTracker obscure rubrum) (F) Graphica repraesentativa (sinistra) et data tabulata (dextra) Ascites et cellulae tumoris. (G) Graphica repraesentativa expressionis CD25, CD137 et PD1 per cytometriam fluxus. (H et I) Expressio CD25, CD137 et PD1 in cellulis T CD4+ (H) et cellulis T CD8+ (I). (J et K) Phenotypi simplices, memoriae centralis (Tcm), effectoris (Teff) et memoriae effectoris (Tem) secundum expressionem CCR7 et CD45RO. Imagines repraesentativae (sinistra) et data tabularia (dextra) cellularum T CD4+ (J) et cellularum T CD8+ (K) in ascitibus et tumoribus. Valores P determinati per test-t par (*P<0.05, **P<0.01 et ***P<0.001). Linea aegros congruentes repraesentat (n = 6). FMO, fluorescentia minus unum; MFI, mediana intensitas fluorescentiae.
Ulterior analysis alias differentias significantes inter statum phenotypicum cellularum T valde resolutum revelavit. Activatio (Figura 1, G ad I) et memoria effectoris (Figura 1, J et K) in tumoribus multo frequentiores sunt quam ascites (proportio cellularum T CD3+). Similiter, analysis phaenotypi per expressionem signorum activationis (CD25 et CD137) et signorum depletionis [proteinum mortis cellularis programmatae 1 (PD1)] ostendit, quamquam notae metabolicae harum populationum differunt (Figura S1, B ad E), nullas differentias metabolicas significantes constanter observatas esse inter subgrupes nativos, effectores vel memoriae (Figura S1, F ad I). Haec eventa confirmata sunt methodis machinalibus discendi ad phaenotypos cellularum automatice assignandos (21), quae ulterius praesentiam magni numeri cellularum medullae ossium (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) in ascite aegroti revelaverunt (Figura S2A). Inter omnes typos cellularum identificatos, haec populatio cellularum myeloidarum maximam absorptionem glucosi et activitatem mitochondrialem ostendit (Figura S2, B ad G). Haec eventa magnas differentias metabolicas inter multiplices typos cellularum in ascitis et tumoribus aegrotorum HGSC inventos illustrant.
Praecipua difficultas in intellegendis proprietatibus metabonomicis TIL est necessitas isolandi exempla cellularum T sufficientis puritatis, qualitatis et quantitatis ex tumoribus. Studia recentiora demonstraverunt methodos separationis et locupletationis globulorum, in cytometria fluxus fundatas, mutationes in profilibus metabolitorum cellularium ducere posse (22-24). Ad hanc difficultatem superandam, methodum locupletationis globulorum optimizavimus ad TIL ex cancro ovarii humani chirurgice resecto isolandum ante analysin per LC-MS/MS (vide Materiales et Methodos; Figura 2A). Ut impulsum generalem huius protocolli in mutationes metabolitorum aestimaremus, profilia metabolitorum cellularum T a donatoribus sanis activatarum post gradum separationis globulorum supradictum cum cellulis quae non globulis separatae sunt sed in glacie manebant comparavimus. Haec analysis qualitatis moderandae invenit magnam correlationem inter has duas condiciones esse (r = 0.77), et repetibilitatem technicam gregis 86 metabolitorum magnam repetibilitatem habere (Figura 2B). Quapropter, hae methodi accuratam metabolitorum analysin in cellulis locupletationem typi cellularis subeuntibus perficere possunt, ita primam suggestum altae resolutionis ad metabolita specifica in HGSC identificanda praebentes, ita homines permittentes ut profundiorem intellectum specificitatis cellularis programmatis metabolismi sexualis adipiscantur.
(A) Schema locupletationis globulorum magneticorum. Ante analysin per LC-MS/MS, cellulae tres continuos circuitus locupletationis globulorum magneticorum subibunt vel in glacie manebunt. (B) Effectus generis locupletationis in abundantiam metabolitorum. Media trium mensurationum pro quolibet genere locupletationis ± SE. Linea grisea relationem 1:1 repraesentat. Correlatio intra-classis (ICC) mensurationum repetitarum in inscriptione axis ostenditur. NAD, nicotinamidum adeninum dinucleotidum. (C) Schema operis analysis metabolitorum aegrotorum. Ascites vel tumores a aegrotis colliguntur et cryopreservantur. Parva pars cuiusque exempli per cytometriam fluxus analysata est, dum exempla reliqua tres circuitus locupletationis pro cellulis CD4+, CD8+ et CD45- subierunt. Hae fractiones cellularum per LC-MS/MS analysatae sunt. (D) Tabula caloris abundantiae metabolitorum normatae. Dendrogramma repraesentat coacervationem Ward distantiarum Euclidianarum inter exempla. (E) Analysis principalis componentium (PCA) mappae metabolitorum exempli, ostendens tres replicationes cuiusque exempli, exempla ab eodem aegroto linea connexa. (F) PCA profili metabolitorum exempli in aegroto condicionati (i.e., utens redundantia partiali); genus exempli involucro convexo limitatur. PC1, componens principalis 1; PC2, componens principalis 2.
Deinde, hanc methodum locupletationis adhibuimus ad 99 metabolitas in fractionibus cellularum CD4+, CD8+ et CD45- in ascitibus primariis et tumoribus sex aegrotorum HGSC (Figura 2C, Figura S3A et Tabula S3 et S4) analyzandas. Populatio quae interest 2% ad 70% exempli magni originalis cellularum viventium constituit, et proportio cellularum inter aegrotos magnopere variat. Post separationem globulorum, fractio locupletata quae interest (CD4+, CD8+ vel CD45-) plus quam 85% omnium cellularum viventium in exemplo mediocriter constituit. Haec methodus locupletationis nobis permittit ut populationes cellularum ex metabolismo textus tumoris humani analyzemus, quod impossibile est ex magnis exemplis facere. Hoc protocollo utentes, determinavimus l-kynureninam et adenosinum, hos duos metabolitas immunosuppressivos bene characterizatos, in cellulis T tumoris vel cellulis tumoris elevatos esse (Figura S3, B et C). Ergo, haec eventa fidelitatem et facultatem technologiae nostrae separationis cellularum et spectrometriae massae demonstrant ad metabolitas biologice importantes in textibus aegrotorum inveniendos.
Nostra analysis etiam firmam separationem metabolicam generum cellularum intra et inter aegros ostendit (Figura 2D et Figura S4A). Praesertim, comparatus cum aliis aegrotis, aegrotus 70 diversas notas metabolicas ostendit (Figura 2E et Figura S4B), indicando fortasse substantialem heterogeneitatem metabolicam inter aegros exstare. Notandum est, comparatum cum aliis aegrotis (1.2 ad 2 litra; Tabula S1), quantitatem totalem ascitis collectae in aegroto 70 (80 ml) minorem fuisse. Moderatio heterogeneitatis inter aegros per analysin principalium componentium (exempli gratia, utens analysi redundantiae partialis) mutationes constantes inter genera cellularum ostendit, et genera cellularum et/vel microambitus clare aggregantur secundum profile metaboliti (Figura 2F). Analysis metabolitorum singularum hos effectus sublineavit et differentias significantes inter genera cellularum et microambitum revelavit. Notandum est differentiam extremam observatam esse MNA, quod plerumque locupletatur in cellulis CD45- et in cellulis CD4+ et CD8+ quae tumorem infiltrant (Figura 3A). In cellulis CD4+, hic effectus est manifestissimus, et MNA in cellulis CD8+ etiam ab ambitu vehementer affici videtur. Attamen hoc non est magni momenti, quia tantum tres ex sex aegrotis pro tumorum CD8+ gradibus aestimari possunt. Praeter MNA, in diversis generibus cellularum in ascitis et tumoribus, alii metaboliti qui parum in TIL describuntur etiam differentialiter divites sunt (Figurae S3 et S4). Ergo, haec data seriem promittentem metabolitorum immunomodulatorum ad ulteriores investigationes revelant.
(A) Contentum MNA normalizatum in cellulis CD4+, CD8+ et CD45- ex ascitis et tumore. Diagramma quadrati medianam (lineam), ambitum interquartilem (cardinem quadrantis) et ambitum datorum ostendit, usque ad 1.5 vices ambitum interquartilem (vibrissa quadrantis). Ut in "Materiis et Methodis Patientis" descriptum est, valorem limma patientis ad determinandum valorem P (*P<0.05 et **P<0.01) adhibe. (B) Diagramma schematicum metabolismi MNA (60). Metabolitae: S-adenosyl-1-methioninum; SAH, S-adenosinum-1-homocysteinum; NA, nicotinamidum; MNA, 1-methylnicotinamidum; 2-PY, 1-methyl-2-pyridonum-5-carboxamidum; 4-PY, 1-methyl-4-pyridonum-5-carboxamidum; NR, nicotinamidi ribosum; NMN, nicotinamidi mononucleotidum. Enzyma (viridis): NNMT, nicotinamidi N-methyltransferasis; SIRT, sirtuina; NAMPT, nicotinamidi phosphoribosyltransferasis; AOX1, aldehydi oxidasis 1; NRK, nicotinamidi ribosidum kinasis; NMNAT, nicotinamidi mononucleotidi adenylatis transferasis; Pnp1, purini nucleosidi phosphorylasis. (C) t-SNE scRNA-seq ascitis (cinerei) et tumoris (rubri; n = 3 aegroti). (D) Expressio NNMT in diversis populationibus cellularum identificatis per scRNA-seq. (E) Expressio NNMT et AOX1 in SK-OV-3, rene embryonali humano (HEK) 293T, cellulis T et cellulis T MNA-tractatis. Expressio complicata ostenditur relativa ad SK-OV-3. Modus expressionis cum SEM ostenditur (n = 6 donatores sani). Valores Ct maiores quam 35 habentur non detectabiles (UD). (F) Expressio SLC22A1 et SLC22A2 in cellulis SK-OV-3, HEK293T, T et cellulis T tractatis cum 8mM MNA. Expressio complicata ostenditur relativa ad SK-OV-3. Exemplar expressionis cum SEM ostenditur (n = 6 donatores sani). Valores Ct maiores quam 35 habentur non detectabiles (UD). (G) Contentum MNA cellulae in cellulis T donatorum sanorum activatis post 72 horas incubationis cum MNA. Exemplar expressionis cum SEM ostenditur (n = 4 donatores sani).
MNA producitur per translationem gregis methylici ex S-adenosyl-1-methionino (SAM) ad nicotinamidum (NA) per nicotinamidum N-methyltransferasem (NNMT; Figura 3B). NNMT superexprimitur in variis cancris humanis et cum proliferatione, invasione et metastasi coniungitur (25-27). Ut melius intellegeretur fons MNA in cellulis T in TME, scRNA-seq usi sumus ad expressionem NNMT trans typos cellularum in ascitis et tumoribus trium aegrotorum HGSC describendam (Tabula S5). Analysis circiter 6500 cellularum demonstravit in ascitis et ambitu tumorum, expressionem NNMT restrictam esse ad praesumptas populationes fibroblastarum et cellularum tumorum (Figura 3, C et D). Notandum est nullam manifestam expressionem NNMT esse in ulla populatione quae PTPRC (CD45+) exprimit (Figura 3D et Figura S5A), quod indicat MNA detectum in spectro metaboliti in cellulas T introductum esse. Expressio aldehydi oxidasis 1 (AOX1) MNA in 1-methyl-2-pyridonum-5-carboxamidum (2-PYR) vel 1-methyl-4-pyridonum-5-carboxamidum (4-PYR) convertit; Figura 3B) etiam ad multitudinem fibroblastarum exprimentium COL1A1 restringitur (Figura S5A), quae simul indicant cellulas T carere facultate metabolismi MNA conventionalis. Modus expressionis horum genorum MNA-relatorum verificatus est utens secundo aggregato datorum cellularum independentium ex ascitibus aegrotorum HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Praeterea, analysis quantitativa reactionis concatenationis polymerasis (qPCR) cellularum T donatorum sanarum cum MNA tractatarum demonstravit, comparatione cum cellulis tumoris ovariani SK-OV-3 controlli, NNMT vel AOX1 fere non expressam esse (Figura 3E). Haec eventa inopinata indicant MNA fortasse ex fibroblastis vel tumoribus in cellulas T adiacentes in TME secretari.
Quamquam candidati familiam transportatorum cationis organici 1 ad 3 (OCT1, OCT2 et OCT3) a familia vectoris solubilis 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 et SLC22A3) codificatorum comprehendunt, transportatores potentiales MNA adhuc indefiniti sunt (28). QPCR mRNA e cellulis T donatoribus sanis expressionis gradus humiles SLC22A1 sed gradus SLC22A2 non detectabiles ostendit, quod confirmavit antea in litteris relatum esse (Figura 3F) (29). Contra, linea cellularum tumoris ovarii SK-OV-3 altos gradus amborum transportatorum expressit (Figura 3F).
Ut possibilitas cellularum T MNA alienum absorbendi exploraretur, cellulae T donatrices sanae per 72 horas in praesentia variarum MNA concentrationum cultae sunt. Absente MNA exogeno, contentum cellulare MNA detegi non potest (Figura 3G). Attamen cellulae T activatae, MNA exogeno tractatae, augmentum contenti MNA in cellulis, pro dosi dependente, usque ad 6 mM MNA ostenderunt (Figura 3G). Hoc resultat indicat, quamvis parvus gradus expressionis transportatoris et absentia enzymi principalis metabolismi MNA intracellularis responsabilis sit, TIL adhuc MNA absorbere posse.
Spectrum metabolitorum in cellulis T aegrotorum et experimenta absorptionis MNA in vitro possibilitatem augent ut fibroblastae cancro associatae (CAF) MNA secernant et cellulae tumorales phaenotypum et functionem TIL moderentur. Ad effectum MNA in cellulas T determinandum, cellulae T donatrices sanae in vitro activatae sunt in praesentia vel absentia MNA, et proliferatio earum et productio cytokinorum aestimatae sunt. Post 7 dies additionis MNA in dosi maxima, numerus duplicationis populationis moderate reductus est, dum vigor in omnibus dosibus conservatus est (Figura 4A). Praeterea, curatio MNA exogena augmentum proportionis cellularum T CD4+ et CD8+ exprimentium factorem necrosis tumoris-α (TNFα; Figura 4B) effecit. Contra, productio intracellularis IFN-γ significanter reducta est in cellulis T CD4+, sed non in cellulis T CD8+, et nulla mutatio significativa in interleukino 2 (IL-2; Figura 4, C et D) fuit. Quapropter, experimentum immunosorbentis coniunctum enzymatico (ELISA) supernatantium ex his culturis cellularum T MNA tractatarum ostendit augmentum significans TNFα, decrementum IFN-γ, et nullam mutationem IL-2 (Figura 4, E ad G). Diminutio IFN-γ indicat MNA munus agere posse in inhibitione actionis antitumoralis cellularum T. Ad simulandum effectum MNA in cytotoxicitatem cellulis T mediatam, cellulae receptoris antigeni chimerici T (FRα-CAR-T) receptorem folati α et cellulas CAR-T (GFP) a proteina fluorescenti viridi (GFP) regulatas (CAR-T) a cellulis mononuclearibus sanguinis peripherici (PBMC) donatoris sanis producuntur. Cellulae CAR-T per 24 horas in praesentia MNA cultae sunt, deinde cum cellulis tumoris ovarii humanis SK-OV-3 receptorem folati α exprimentibus ratione effectoris ad scopum 10:1 co-cultae. Curatio MNA effecit ut vis necandi cellularum FRα-CAR-T decresceret significanter, quae similis erat cellulis FRα-CAR-T adenosino tractatis (Figura 4H).
(A) Numerus totalis cellularum viabilium et duplicatio populationis (PD) directe ex cultura die 7. Graphum columnare mediam + SEM sex donatorum sanorum repraesentat. Data ex saltem n = 3 experimentis independentibus repraesentat. (B ad D) CD3/CD28 et IL-2 adhibita sunt ad cellulas T in suis concentrationibus MNA respectivis per 7 dies activandas. Ante analysin, cellulae cum PMA/ionomycina cum GolgiStop per 4 horas stimulatae sunt. Expressio TNFα (B) in cellulis T. Imago exempli (sinistra) et data tabularia (dextra) expressionis TNFα in cellulis viventibus. Expressio IFN-γ (C) et IL-2 (D) in cellulis T. Expressio cytokinorum per cytometriam fluxus mensurata est. Graphum columnare mediam (n = 6 donatores sani) + SEM repraesentat. Analysin variantiae unidirectionalem et mensuras repetitas (*P<0.05 et **P<0.01) ad valorem P determinandum adhibe. Data ex saltem n = 3 experimentis independentibus repraesentat. (E ad G) CD3/CD28 et IL-2 adhibita sunt ad cellulas T activandas in suis concentrationibus MNA respectivis per 7 dies. Medium ante et post 4 horas stimulationis PMA/ionomicinae collectum est. Concentrationes TNFα (E), IFN-γ (F) et IL-2 (G) per ELISA mensuratae sunt. Graphum columnarium mediam (n = 5 donatores sani) + SEM repraesentat. Valor P determinatus est utens analysi variantiae unidirectionali et mensuris repetitis (*P<0.05). Linea punctata limitem detectionis indicat. (H) Examen lysis cellularum. Cellulae FRα-CAR-T vel GFP-CAR-T cum adenosino (250μM) vel MNA (10 mM) per 24 horas accommodatae sunt, vel non tractatae relictae (Ctrl). Percentatio necis cellularum SK-OV-3 mensurata est. Valor P determinatus est per probationem t Welch (*P<0.5 et **P<0.01).
Ut mechanismus regulationis expressionis TNFα a MNA dependentis intellegeretur, mutationes in mRNA TNFα cellularum T MNA tractatarum aestimatae sunt (Figura 5A). Cellulae T donatrices sanae, MNA tractatae, duplicem augmentum in gradibus transcriptionis TNFα ostenderunt, quod indicat MNA a regulatione transcriptionis TNFα pendere. Ad hunc possibilem mechanismum regulationis investigandum, duo factores transcriptionis noti qui TNFα regulant, nempe factor nuclearis cellulae T activatae (NFAT) et proteina specifica 1 (Sp1), in responsione ad ligationem MNA cum promotore TNFα proximali aestimati sunt (30). Promotor TNFα sex locos ligationis NFAT identificatos et duos locos ligationis Sp1 continet, uno loco inter se congruentes [-55 paria basium (bp) ab operculo 5'] (30). Immunopraecipitatio chromatini (ChIP) demonstravit, cum MNA tractatum est, ligationem Sp1 cum promotore TNFα triplicem auctam esse. Incorporatio NFAT etiam aucta est et momenti accessit (Figura 5B). Haec data indicant MNA expressionem TNFα per transcriptionem Sp1, et minore gradu expressionem NFAT, moderari.
(A) Comparata cum cellulis T sine MNA culta, mutatio expressionis TNFα in cellulis T cum MNA tractatis. Modus expressionis cum SEM ostenditur (n = 5 donatores sani). Repraesentat data ex saltem n = 3 experimentis independentibus. (B) Promotor TNFα cellularum T tractatarum cum vel sine 8 mM MNA postquam NFAT et Sp1 cum (Ctrl) et stimulatione PMA/ionomycina per 4 horas combinata sunt. Immunoglobulinum G (IgG) et H3 ut moderamina negativa et positiva pro immunopraecipitatione, respective, adhibita sunt. Quantificatio ChIP ostendit nexum Sp1 et NFAT cum promotore TNFα in cellulis cum MNA tractatis pluries auctum esse comparatum cum moderamine. Repraesentat data ex saltem n = 3 experimentis independentibus. Valor P determinatus per probationes t multiplices (*** P <0.01). (C) Comparata cum ascitibus HGSC, cellulae T (non-cytotoxicae) expressionem auctam TNF in tumore ostenderunt. Colores aegros diversos repraesentant. Cellulae exhibitae ad 300 temere selectae et tremulae sunt ad nimiam attractionem minuendam (** Padj = 0.0076). (D) Exemplar propositum MNA pro cancro ovarii. MNA in cellulis tumoralibus et fibroblastis in TME producitur et a cellulis T absorbetur. MNA nexum Sp1 cum promotore TNFα auget, quod ad maiorem transcriptionem TNFα et productionem cytokinorum TNFα ducit. MNA etiam diminutionem IFN-γ efficit. Inhibitio functionis cellularum T ad facultatem necandi reductam et incrementum tumoris acceleratum ducit.
Secundum relationes, TNFα effectus antitumorales et antitumorales anteriores et posteriores habet, sed munus notum in promovenda accretione et metastasi cancri ovarii agit (31-33). Secundum relationes, concentratio TNFα in ascitis et textibus tumoralibus in aegrotis cum cancro ovarii maior est quam in textibus benignis (34-36). Quod ad mechanismum attinet, TNFα activationem, functionem et proliferationem leucocytorum moderari potest, et phaenotypum cellularum cancrarum mutare (37, 38). His inventis congruens, analysis expressionis genorum differentialis demonstravit TNF significanter auctum esse in cellulis T in textibus tumoralibus comparatis cum ascitis (Figura 5C). Incrementum expressionis TNF solum manifestum erat in populationibus cellularum T cum phaenotypo non-cytotoxico (Figura S5A). In summa, haec data opinionem confirmant MNA effectus duplices immunosuppressivos et tumorem promoventes in HGSC habere.
Notatio fluorescens, cytometria fluxus innixa, methodus principalis ad metabolismum TIL investigandum facta est. Haec studia demonstraverunt TIL murinos et humanos, comparatos cum lymphocytis sanguinis peripherici vel cellulis T ex organis lymphoideis secundariis, maiorem proclivitatem ad glucosum absorbendum habere (4, 39) et gradatim functionis mitochondrialis iacturam (19, 40). Quamquam similia in hoc studio observavimus, progressus clavis est metabolismum cellularum tumoris et TIL ex eodem textu tumoris resecto comparare. Congruenter cum quibusdam ex his relationibus prioribus, cellulae tumoris (CD45-EpCAM+) ex ascitis et tumoribus maiorem glucosi absorptionem habent quam cellulae T CD8+ et CD4+, confirmantes altam glucosi absorptionem cellularum tumoris cum cellulis T comparari posse. Conceptus competitionis cellularum T. TME. Attamen, activitas mitochondrialis cellularum tumoris maior est quam cellularum T CD8+, sed activitas mitochondrialis similis est ei cellularum T CD4+. Haec eventa thema emergentem confirmant metabolismum oxidativum magni momenti esse pro cellulis tumoris (41, 42). Suggerunt etiam cellulas CD8+ T fortasse magis obnoxias dysfunctioni oxidativae quam cellulas CD4+ T, vel cellulas CD4+ T fortasse fontes carbonis alios quam glucosum ad activitatem mitochondrialem conservandam uti (43, 44). Notandum est nos nullam differentiam in absorptione glucosi vel activitate mitochondriali inter effectores CD4+ T, memoriam effectoris T et cellulas memoriae centralis T in ascitis observasse. Similiter, status differentiationis cellularum CD8+ T in tumoribus nihil habet commune cum mutationibus in absorptione glucosi, quod differentiam significantem inter cellulas T in vitro cultas et TIL humanas in vivo illustrat (22). Hae observationes etiam confirmatae sunt usu assignationis automaticae populationis cellularum impartialis, quae ulterius revelavit cellulas CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ cum altiore absorptione glucosi et activitate mitochondriali quam cellulae tumoris praevalentes esse sed populationem cellularum metabolice activam habere. Haec populatio subpopulationem putativam cellularum myeloidarum suppressoriarum vel cellularum dendriticarum plasmacytoidarum in analysi scRNA-seq identificatarum repraesentare potest. Quamquam ambo haec in tumoribus ovariorum humanorum relata sunt [45], tamen adhuc opus est ut haec subpopulatio myeloidea describatur.
Quamquam methodi cytometriae fluxus innixae differentias generales in glucoso et metabolismo oxidativo inter genera cellularum elucidare possunt, metaboliti precisi a glucoso vel aliis fontibus carbonis ad metabolismum mitochondriale in TME producti nondum determinati sunt. Assignatio praesentiae vel absentiae metabolitorum datae subcategoriae TIL requirit purificationem populationis cellularum ex textu exciso. Ergo, nostra methodus locupletationis cellularum cum spectrometria massae coniuncta perspicientiam in metabolitos qui differentialiter locupletantur in cellulis T et populationibus cellularum tumoris in exemplaribus aegrotorum congruentibus praebere potest. Quamquam haec methodus commoda habet prae separatione cellularum fluorescentia activata, quaedam bibliothecae metabolitorum affici possunt propter stabilitatem inherentem et/vel celerem ratem conversionis (22). Nihilominus, nostra methodus duos metabolitos immunosuppressivos agnitos, adenosinum et kynureninum, identificare potuit, quia inter genera exemplorum magnopere variant.
Nostra analysis metabonomica tumorum et subtyporum TIL plura perspicientia in munus metabolitorum in TME ovariorum praebet. Primo, cytometria fluxus utens, determinavimus nullam differentiam in activitate mitochondriali inter tumores et cellulas T CD4+ esse. Attamen, analysis LC-MS/MS mutationes significantes in abundantia metabolitorum inter has populationes revelavit, indicando conclusiones de metabolismo TIL et eius activitate metabolica generali interpretationem diligentem requirere. Secundo, MNA est metabolitus cum maxima differentia inter cellulas CD45 et cellulas T in ascitis, non tumoribus. Ergo, compartimentalizatio et situs tumoris effectus diversos in metabolismo TIL habere possunt, quod heterogeneitatem possibilem in dato microambiente illustrat. Tertio, expressio enzymi NNMT MNA producentis praecipue ad CAF limitatur, quod cellulae tumoris minore gradu est, sed gradus MNA detectabiles in cellulis T tumore derivatis observantur. Superexpressio NNMT in CAF ovariorum effectum cancrum promovens notum habet, partim propter promotionem metabolismi CAF, invasionis tumoris et metastasis (27). Quamquam TIL gradus generalis moderatus est, expressio NNMT in CAF arcte cum subtypo mesenchymali Cancer Genome Atlas (TCGA) coniungitur, qui cum prognosi mala coniungitur (27, 46, 47). Denique, expressio enzymi AOX1, quod degradationem MNA efficit, etiam ad populationem CAF limitatur, quod indicat cellulas T facultatem metabolizandi MNA deesse. Haec eventa ideam confirmant, quamquam ulteriores investigationes necessariae sunt ad hoc inventum verificandum, altas gradus MNA in cellulis T praesentiam microambitus CAF immunosuppressivi indicare posse.
Ob humilem expressionis gradum transportatorum MNA et proteinorum clavium metabolismo MNA implicatorum gradus non detectabiles, praesentia MNA in cellulis T inexpectata est. Neque NNMT neque AOX1 per analysin scRNA-seq et qPCR directam duarum cohortium independentium detegi potuerunt. Haec eventa indicant MNA non a cellulis T synthesizari, sed ab TME circumstante absorberi. Experimenta in vitro ostendunt cellulas T MNA exogenum accumulare solere.
Studia nostra in vitro demonstraverunt MNA exogenum expressionem TNFα in cellulis T inducere et nexum Sp1 cum promotore TNFα augere. Quamquam TNFα et functiones antitumorales et antitumorales habet, in cancro ovarii, TNFα incrementum cancri ovarii promovere potest (31-33). Neutralizatio TNFα in cultura cellularum tumoris ovarii vel eliminatio signi TNFα in exemplaribus muribus productionem cytokinorum inflammatoriorum TNFα-mediatam emendare et incrementum tumoris inhibere potest (32, 35). Ergo, hoc in casu, MNA a TME derivatum ut metabolitus pro-inflammatorius per mechanismum TNFα-dependentem per ansam autocrinam agere potest, ita eventum et propagationem cancri ovarii promovens (31). Hac possibilitate innixa, obsidio TNFα ut agens therapeuticum potentiale pro cancro ovarii investigatur (37, 48, 49). Praeterea, MNA cytotoxicitatem cellularum CAR-T erga cellulas tumoris ovarii impedit, ulteriores probationes pro suppressione immunitatis MNA-mediata praebens. Haec omnia simul inventa exemplar suggerunt quo tumores et cellulae CAF MNA in TME extracellulare secernunt. Per (i) stimulationem crescentiae cancri ovarii a TNF inductam et (ii) inhibitionem activitatis cytotoxicae cellularum T a MNA inductam, hoc effectum tumoris duplicem habere potest (Figura 5D).
In conclusione, per combinationem rapidae locupletationis cellularum, sequentiationis singularum cellularum, et delineationis metabolicae, hoc studium ingentes differentias immunometabolomicas inter tumores et cellulas asciticas in aegris cum HGSC revelavit. Haec analysis comprehensiva ostendit differentias in absorptione glucosi et activitate mitochondriali inter cellulas T esse, et MNA ut metabolitum immune regulatorium autonomum non-cellulare identificavit. Haec data momentum habent in quomodo TME metabolismum cellularum T in cancris humanis afficit. Quamquam certamen directum pro nutrimentis inter cellulas T et cellulas cancrarias relatum est, metaboliti etiam ut regulatores indirecti agere possunt ad progressionem tumoris promovendam et fortasse responsa immune endogena supprimere. Ulterior descriptio muneris functionalis horum metabolitorum regulatoriorum strategias alternativas ad responsum immune antitumorale amplificandum aperire potest.
Exempla aegrotorum et notitia clinica per repositorium textuum tumorum cancri Columbiae Britannicae, a Rete Depositorii Textuum Canadensi (Canadian Tissue Repository Network) probatum, obtenta sunt. Secundum protocollum a BC Cancer Research Ethic Committee et Universitate Columbiae Britannicae (H07-00463) approbatum, omnia exempla et notitia clinica aegrotorum consensum scriptum informatum obtinuerunt vel consensum formaliter renuntiaverunt. Exempla in BioBank (BRC-00290) probato servantur. Proprietates aegrotorum singulae in Tabulis S1 et S5 monstrantur. Ad cryopreservationem, scalpellum adhibetur ad exemplum tumoris aegroti mechanice dissolvendum, deinde per filtrum 100 micron impellitur ad suspensionem cellularum singularum obtinendam. Ascites aegroti centrifugata est ad 1500 rpm per 10 minuta ad 4°C ad cellulas componendas et supernatans removendum. Cellulae ex tumore et ascitis obtentae cryopreservatae sunt in sero humano AB 50% calore inactivato (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) et 10% dimethylsulfoxido. Hae suspensiones cellularum singularum conservatae liquefactae et ad metabolomicam et determinationem metabolitorum infra descriptam adhibitae sunt.
Medium completum constat ex 0.22 μm filtrato 50:50 supplemento RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamini (Thermo Fisher Scientific) supplemento cum 10% sero humano AB calore inactivato (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamini (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific, 1 x solutione Penicillini Streptomycini (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) et 50 μMB-mercaptoethanolo. AimV (Invitrogen) suppletur cum 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) et 2 mM l-glutamini (Thermo Fisher Scientific). Liquor tinctorius cytometri fluxus constabat ex 0.22 μm solutione salina filtrata phosphate tamponata (PBS; Invitrogen) supplemento cum 3% sero humano AB calore inactivato (Sigma). Liquor locupletans cellularum constat ex PBS filtrato 0.22μm et suppletur 0.5% sero humano AB calore inactivato (Sigma-Aldrich).
In medio completo 37°C, cellulae tinctae sunt cum 10 nM MT DR et 100 μM 2-NBDG per 30 minuta. Deinde, cellulae tinctura viabilitatis eF506 ad 4°C per 15 minuta tinctae sunt. Cellulas resuspende in FC Block (eBioscience) et Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), dilue in flow cytometer staining buffer (secundum instructiones fabricatoris), et incuba per 10 minuta ad temperaturam ambientem. Cellulas tinge cum serie anticorporum (Tabula S2) in flow cytometry staining buffer ad 4°C per 20 minuta. Cellulas resuspende in flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; configuratione 3L-16V-14B-8R) ante analysin. Utere SpectroFlo et FlowJo V10 ad analysandum data numeri cellularum, et utere GraphPad Prism 8 ad creanda data. Mediana intensitatis fluorescentiae (MFI) 2-NBDG et MT DR log-normalizata est, deinde probatio t parium ad analysin statisticam adhibita est ad aegros congruentes computandos. Omnes populationes cum minus quam 40 eventibus ex analysi remove; valorem MFI 1 pro quibuslibet valoribus negativis inscribe antequam analysin statisticam et visualisationem datorum perficias.
Ut rationem manualem obturationis tabulae processus supradictae suppleremus, annotationem plenam per arborem restrictionis formae (FAUST) (21) adhibuimus ut cellulas populationi automatice assignaremus post eliminationem cellularum mortuarum in FlowJo. Exitum manu administramus ut populationes quae male allocatae videntur (cellulis PD1+ cum cellulis tumoris PD1 coniungentes) et populationes retentas coniungamus. Quaeque specimina plus quam 2% cellularum continet, in summa undecim populationum.
Centrifugatio densitatis gradientis Ficoll adhibita est ad separandas cellulas mononucleares cum nucleotidis periphericis (PBMC) a productis separationis leucocytorum (STEMCELL Technologies). Cellulae T CD8+ ex PBMC isolatae sunt utens Microsphaeris CD8 (Miltenyi) et expansae in medio completo utens TransAct (Miltenyi) per duas hebdomades secundum instructiones fabricatoris. Cellulae per quinque dies in medio completo IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) continenti stare permissae sunt, deinde cum TransAct iterum stimulatae sunt. Die septimo, secundum instructiones fabricatoris, Microsphaerae CD45 humanae (Miltenyi) ad cellulas locupletandas tribus vicibus continuis adhibitae sunt. Cellulae in aliquotas divisae sunt ad analysin cytometriae fluxus (ut supra descriptum est), et decies centena milia cellularum ter divisa est ad analysin LC-MS/MS. Exempla per LC-MS/MS tractata sunt ut infra descriptum est. Valorem metaboliti absentis cum numero ionum 1000 aestimavimus. Quodque exemplum per numerum ionicum totalem (TIC) normalizatur, logarithmice convertitur et in MetaboAnalystR ante analysin automatice normalizatur.
Suspensio singularum cellularum singulorum aegrotorum liquefacta et per filtrum 40 μm in medium completum filtrata est (ut supra descriptum est). Secundum protocollum fabricatoris, tres circuitus continui selectionis positivae per separationem globulorum magneticorum utens MicroBeads (Miltenyi) adhibiti sunt ad locupletandas exempla pro cellulis CD8+, CD4+ et CD45- (in glacie). Breviter, cellulae in liquore locupletationis cellularum resuspenduntur (ut supra descriptum est) et numerantur. Cellulae cum globulis humanis CD8, globulis humanis CD4 vel globulis humanis CD45 (Miltenyi) ad 4°C per 15 minuta incubatae sunt, deinde liquore locupletationis cellularum lavatae. Exemplum per columnam LS (Miltenyi) transmittitur, et fractiones positivae et negativae colliguntur. Ad durationem reducendam et gradum recuperationis cellularum amplificandum, fractio CD8 deinde ad secundum circuitum locupletationis CD4+, et fractio CD4 ad subsequentem locupletationem CD45 adhibetur. Solutio in glacie per totum processum separationis servanda est.
Ad exempla ad analysin metabolitorum praeparanda, cellulae semel solutione salina glaciali lavatae sunt, et 1 ml methanoli 80% singulis exemplis additum est, deinde vortex agitata et in nitrogenio liquido subito congelata. Exempla tribus cyclis congelationis-liquefactionis subiecta sunt et ad 14,000 rpm per 15 minuta ad 4°C centrifugata. Supernatans metabolitos continens evaporatum est donec exsiccatum esset. Metabolitae iterum dissolutae sunt in 50 μl acidi formici 0.03%, vortex agitatae ad miscendum, et deinde centrifugatae ad purgandum residuum.
Metabolita extrahe ut supra descriptum est. Supernatans in ampullam chromatographiae liquidae altae efficaciae ad investigationem metabolomicam transfer. Protocollo curationis fortuito utere ad singula specimina cum simili numero cellularum tractanda ad effectus fasciculorum vitandos. Aestimationem qualitativam metabolitarum globalium, antea in AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) publicatam, perfecimus. Analysis chromatographica et integratio areae apicis peractae sunt utens programmate MultiQuant versione 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Numerus ionum 1000 ad aestimandum valorem metaboliti absentis adhibitus est, et TIC (Intensity Coetus) cuiusque exempli ad computandam aream apicis normalizatam cuiusque metaboliti detecti ad corrigendum mutationes ab analysi instrumentali ex processu exempli introductas. Postquam TIC normalizatum est, MetaboAnalystR(51) (parametrus implicitus) ad conversionem logarithmicam et scalationem automaticam lineae normae adhibetur. PCA cum fasciculo vegano R adhibuimus ad peragendam analysin exploratoriam differentiarum metabolomi inter genera exemplorum, et analysin redundantiae partialis ad analysandum aegros. Methodum Ward adhibuimus ad construendum dendrogramma mappae caloris ad congregandum distantiam Euclidianam inter exempla. Limma (52) in abundantia metaboliti normata adhibuimus ad identificandos metabolitos differentialiter abundantes per totum typum cellulae et microambitum. Ad explicationem simplificandam, parametrum medii gregis adhibuimus ad specificandum exemplar, et genera cellularum in microambitu ut singulos greges consideramus (n = 6 greges); ad probationem significationis, tres mensuras repetitas pro singulis metabolitis perfecimus. Ad vitandam falsam replicationem, aegrotus ut impedimentum in consilio limmae inclusus est. Ut differentias metabolitorum inter diversos aegros exploraremus, exemplar limmae, aegros modo fixo includens, accommodavimus. Significationem praedefinitae differentiae inter typum cellulae et microambitum Padj <0.05 (correctio Benjamini-Hochberg) referimus.
Post vigorem locupletatum utens Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilitate), sequentia transcriptomum singularum cellularum peracta est in ascitis vivis congelatis et exemplaribus tumorum utens protocollo expressionis genorum 10x 5′. Quinque casus cum tumoribus et ascitis congruentibus analysati sunt, quamquam viabilitas humilis ex uno exemplo tumoris inclusionem eius prohibuit. Ut selectiones multiplices aegrotorum obtinerentur, exempla singulorum aegrotorum in viis moderatoris chromii 10x coniunximus, et ascites et loca tumorum separatim analysimus. Post sequentiationem [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; Cum mediocri 73 488 et 41 378 lectionibus per cellulam pro tumore et ascite respective]], CellSNP et Vireo (53) usi sumus (innixum CellSNP ut SNP humanum commune (VCF) a GRCh38 provisum identitate donatoris assignatur. SNPRelate utimur ad identitatem proximam (IBS) status genotypi aegroti (IBS) inferendam, excludendo cellulas non assignatas et cellulas ut duplexas identificatas et donatores inter ascites et exempla tumoris congruentes (54). Innixum hoc muneri, tres casus cum repraesentatione cellularum abundanti in tumore et ascite ad analysin subsequentem retinuimus. Postquam gradum filtrationis massae in involucro BioConductor scater (55) et scran (56) peractum est, hoc 6975 cellulas (2792 et 4183 cellulas ex tumore et ascite, respective) ad analysin produxit. Aggregationem Louvain igraph (57) retiaculi vicini proximi communicati (SNN) innixam distantiae Jaccard ad cellulas aggregatas per utimur. expressionem. Glomeruli manu ad putativos cellularum typos, secundum expressionem genorum indicatorum, annotati sunt et cum t-SNE visualizati. Cellulae T cytotoxicae per expressionem CD8A et GZMA definiuntur, exclusis subglomerulis cum humili expressione proteini ribosomalis. Ad data edita ab Izar et al. (16) accessimus, inclusa eorum inclusione t-SNE, quae superpositionem expressionis inter indices cellularum immunium et expressionem NNMT moderari potest.
Cellulae mononucleares nucleorum (PBMC) a productis separationis leucocytorum (STEMCELL Technologies) per centrifugationem densitatis gradientis Ficoll separatae sunt. Cellulae CD3+ ex PBMC per globulos CD3 (Miltenyi) isolatae sunt. Praesente vel absente MNA, cellulae CD3+ cum CD3 in lamina ligato (5μg/ml), CD28 solubili (3μg/ml) et IL-2 (300 U/ml; Proleukin) activatae sunt. Die ultimo expansionis, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) et proliferatio (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) per cytometriam fluxus aestimatae sunt. Functionem effectoris aestimare per stimulationem cellularum cum PMA (20 ng/ml) et ionomycina (1 μg/ml) cum GolgiStop per 4 horas, et monitorare CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) et TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Stimulare cellulas qPCR et ChIP cum PMA (20 ng/ml) et ionomycina (1 μg/ml) per 4 horas. Supernatans ELISA collectum est ante et post stimulationem cum PMA (20 ng/ml) et ionomycina (1 μg/ml) per 4 horas.
Protocollum fabricatoris sequere ad RNA isolandum utens RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). QIAshredder (QIAGEN) ad exemplum homogenizandum utere. Kit RNA ad cDNA magnae capacitatis (Thermo Fisher Scientific) ad synthesim DNA complementaris (cDNA) adhibe. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ad quantificandam expressionem genorum (secundum protocollum fabricatoris) cum sequentibus specillis utere: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehydi-3-phosphatis ex Hydrogeno (GAPDH)] et Hs01010726_m1 (SLC22A2). Exempla in systemate PCR temporis realis StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) in lamina reactionis opticali rapida MicroAmp 96-putorum (Applied Biosystems) cum pellicula optica MicroAmp posita sunt. Quilibet valor Ct qui 35 excedit, supra limen detectionis habetur et ut non detectabilis notatur.
ChIP perage ut antea descriptum est (58). Breviter, cellulae formaldehydo tractatae sunt (concentratione finali 1.42%) et ad temperaturam ambientem per 10 minuta incubatae. Utere liquore inflammatorio supplementato (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl et 0.1% NP-40) in glacie per 10 minuta, deinde resuspende in liquore immunopraecipitationis ut descriptum est (58). Deinde exemplum sonicatum est his cyclis: 10 cycli (20 pulsus 1 secundi) et tempore statico 40 secundorum. Immunoglobulinum G (Cell Signaling Technology; 1μl), histonem H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) et anticorpora SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) gradus ChIP cum exemplo ad 4°CC per noctem agita. Incubate globulos proteini A (Thermo Fisher Scientific) cum exemplo ad 4°C leniter agitatos per horam unam, deinde globulos Chelex (Bio-Rad) ad DNA locupletandum adhibe, et proteinasem K (Thermo Fisher) ad digestionem proteinorum adhibe. Promotor TNFα per PCR detectus est: progrediens, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; contra, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (productum 207-bp). Imagines ab Image Lab (Bio-Rad) productae et per programmata ImageJ quantificatae sunt.
Supernatans culturae cellularum sicut supra descriptum est collectum est. Determinatio secundum rationes fabricatoris instrumenti humani TNFα ELISA (Invitrogen), instrumenti humani IL-2 ELISA (Invitrogen) et instrumenti humani IFN-γ ELISA (Abcam) peracta est. Secundum protocollum fabricatoris, supernatans dilutum est 1:100 ad TNFα et IL-2 detegendum, et 1:3 ad IFN-γ detegendum. Adhibe Lectore Multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) ad absorbentiam ad 450 nm metiendam.
Cellulae mononucleares cytocytorum (PBMC) a productis separationis leucocytorum (STEMCELL Technologies) per centrifugationem densitatis gradientis Ficoll separatae sunt. Cellulae CD3+ a PBMC per globulos CD3 (Miltenyi) isolatae sunt. Praesente vel absente MNA, cellulae CD3+ cum CD3 in lamina ligato (5μg/ml), CD28 solubili (3μg/ml) et IL-2 (300 U/ml; Proleukin) per tres dies activatae sunt. Post tres dies, cellulae collectae et cum solutione salina 0.9% lavatae sunt, et sedimentum subito congelatum est. Numeratio cellularum per cytometriam fluxus (Cytek Aurora; configurationem 3L-16V-14B-8R) peracta est, utens globulis electronicis 123count.
Metabolita extrahantur ut supra descriptum est. Extractum siccum reconstitutum est ad concentrationem 4000 aequivalentium cellularum/μl. Exemplum per chromatographiam phasis inversae (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) et columnam CORTECS T3 (2.1×150 mm, magnitudo particularum 1.6-μm, magnitudo pororum 120-Å; #186008500, Waters) analysatur. Spectrometrum massae polaris (6470, Agilent), in quo ionizatio electrospray in modo positivo operatur. Phase mobilis A est 0.1% acidum formicum (in H2O), phase mobilis B est 90% acetonitrilum, 0.1% acidum formicum. Gradiens LC est 0 ad 2 minuta pro 100% A, 2 ad 7.1 minuta pro 99% B, et 7.1 ad 8 minuta pro 99% B. Deinde columnam cum phase mobili A iterum aequilibra ad fluxum 0.6 ml/min per 3 minuta. Fluxus est 0.4 ml/min, et camera columnae calefacta est ad 50°C. Utere norma chemica pura MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ad tempus retentionis (RT) et transformationem constituendas (RT = 0.882 minuta, transformatio 1 = 137→94.1, transformatio 2 = 137→92, conversio 3 = 137→78). Cum omnes tres transitiones tempore retentionis correcto fiunt, transitio 1 ad quantificationem adhibetur ad specificitatem confirmandam. Curva norma MNA (Toronto Research Chemical Company) generata est per sex dilutiones seriales solutionis principalis (1 mg/ml) ad normas 0.1, 1.0, 10, et 100 ng/ml et 1.0 et 10 μg/ml respective liquidi obtinendas. Limes detectionis est 1 ng/ml, et responsio linearis est inter 10 ng/ml et 10 μg/ml. Quaeque iniectio duorum microlitrorum exempli et normae ad analysin LC/MS adhibetur, et exemplum mixtum qualitatis moderandae singulis octo iniectionibus currit ad stabilitatem suggestus analysis confirmandam. Responsa MNA omnium exemplorum cellularum MNA tractatarum intra ambitum linearem probationis erant. Analysis datorum facta est utens programmate analysis quantitativae MassHunter (v9.0, Agilent).
Structura αFR-CAR secundae generationis a Song et al. (59) sumpta est. Breviter, structura haec continet: sequentiam ductoriam CD8a, fragmentum variabilem singularis catenae humanae αFR-specificum, regionem cardinis et transmembranae CD8a, dominium intracellulare CD27 et dominium intracellulare CD3z. Sequentia CAR completa per GenScript synthesizata est, deinde in vectorem expressionis lentiviralis secundae generationis ante cassettam expressionis GFP adhibitam ad efficientiam transductionis aestimandam clonata.
Lentivirus producitur per transfectionem cellularum HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)]; in medio Dulbecco modificato Eagle cum 10% sero bovino fetali (FBS) et 1% PenStrep cultis, et vectore CAR-GFP usus est. Plasmida involucri (psPAX2 et pMD2.G, Addgene) aminam lipofectionis (Sigma-Aldrich) utuntur. Supernatans virus continens 48 et 72 horis post transfectionem collectum, filtratum, et ultracentrifugatione concentratum est. Supernatans virale concentratum ad -80°C usque ad transductionem conservandum.
Cellulis CD8+ a donatoribus sanis (STEMCELL Technologies) separandis per centrifugationem densitatis gradientis Ficoll, PBMC separantur. Microsphaerulis CD8 selectionis positivae (Miltenyi) utere ad cellulas CD8+ a PBMC isolandas. Cellulas T cum TransAct (Miltenyi) et in medio TexMACS [Miltenyi; supplemento cum 3% sero humano calore inactivato, 1% PenStrep et IL-2 (300 U/ml)] stimula. Horis viginti quattuor post stimulationem, cellulae T cum lentiviro (10 μl supernatantis viralis concentrati per 10⁶ cellulas) transductae sunt. Post 1 ad 3 dies post transductionem in Cytek Aurora (in FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), expressionem GFP cellularum aestima ut efficientiam transductionis saltem 30% demonstres.
Cellulae CAR-T per 24 horas in Immunocult (STEMCELL Technologies; supplemento 1% PenStrep) sub sequentibus condicionibus cultae sunt: ​​non tractatae, tractatae cum 250 μM adenosino vel 10 mM MNA. Post praecurationem, cellulae CAR-T cum PBS ablutae et cum 20,000 cellulis SK-OV-3 [ATCC; in medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplemento 10% FBS et 1% PenStrep ad 10°C combinatae sunt. Ratio effectoris ad scopum 1 triplicata in medio Immunocult supplemento amplificata est. Cellulae SK-OV-3 et cellulae SK-OV-3 cum digitali saponino (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) lysatae ut negativae et positivae respective moderationes adhibitae sunt. Post viginti quattuor horas co-cultationis, supernatans collectum est et lactato dehydrogenasum (LDH) secundum instructiones fabricatoris (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) mensuratum est. Supernatans LDH in solutione LDH 1:50 dilutum est. Percentatio necis hac formula mensurata est: percentatio necis = percentatio correctionis / maxima necis rata × 100%, ubi percentatio correctionis = co-cultura - cellulae T tantum, et maxima necis rata = control positivum - control negativum.
Ut in textu vel materiis et methodis describitur, GraphPad Prism 8, Microsoft Excel vel R v3.6.0 ad analysin statisticam adhibe. Si plura exempla ab eodem aegroto colliguntur (ut ascites et tumor), probationem t pariter factam adhibemus vel aegrotum ut effectum fortuitum in modello lineari vel generali, prout aptum est, includimus. Ad analysin metabolomicam, probatio momenti triplicate perficitur.
Pro materiis supplementis ad hunc articulum, vide quaeso http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Hic est articulus apertus et sub condicionibus Licentiae Creative Commons Attribution-Non-Commercial distributus, quae usum, distributionem et reproductionem in quolibet medio permittit, dummodo usus finalis non sit ad lucrum commercialem et praemissa sit opus originale rectum esse. Referentia.
Nota: Solum rogamus ut inscriptionem electronicam tuam praebeas, ut persona quam paginae commendas sciat te velle eam videre epistulam et eam non esse spam. Nullas inscriptiones electronicas capemus.
Haec quaestio adhibetur ad explorandum utrum sis visitator et ad prohibendam submissionem automaticam epistularum inutilium.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Radulphus J. De Jones Bellardini (Ralph G. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ad immunosuppressionem cellularum T confert et scopum immunotherapiae potentialem ad curationem cancri humani repraesentat.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Radulphus J. De Jones Bellardini (Ralph G. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ad immunosuppressionem cellularum T confert et scopum immunotherapiae potentialem ad curationem cancri humani repraesentat.
©2021 American Associationis ad profectum Scientiae. omnia iura reservata. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et CONTRA. ISSN 2375-2548.